[发明专利]利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导性多能干细胞(iPSCs)的方法，具体包括下列步骤：1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养；2)牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建；3)逆转录病毒的包装与准备；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得。本发明首次采用脱细胞后人羊膜作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞来维持牛iPSCs体外增殖并长期保持未分化的多能性状态。这种采用基因诱导产生多能性干细胞的策略，不但解决了家畜特别是牛多能性干细胞难以获得的技术难题，而且避免了应用鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。

主权项

利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养以成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生牛皮肤成纤维细胞NDFs经常规培养分别获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；2)牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建从50-60日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总RNA，经过逆转录反应得到cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛Oct4、Sox2和Klf4三个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒载体pMSCVneo中，构建这3种基因的逆转录病毒表达载体；3)逆转录病毒的包装与准备将PT67包装细胞按照常规方法培养在含有15％胎牛血清的DMEM培养基中，应用脂质体将构建的逆转录病毒转染进入包装细胞PT67细胞；将8μg含有Oct4、Sox2和Klf4三个不同基因的逆转录病毒表达载体质粒和3份20μl转染试剂脂质体lipofectamine2000分别用500μl Opti-MEM-I+GlutaMAX-I转染优化液进行稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟，然后将含有脂质体lipofectamine2000的稀释液缓慢滴入含有逆转录病毒质粒的稀释液中，轻轻混匀，室温下再孵育20分钟后，然后将上述混合液逐滴加入PT67包装胞培养皿中；转染24小时后，每天更换含有病毒颗粒培养液一次，连续3天，收集病毒悬浮液，在4℃条件下经25000转/分离心90分钟后，10倍浓缩病毒上清液；将含有Oct4、Sox2和Klf4三个基因病毒上清液进行等量混合，并加入8μg/ml Polybrene组成特定的三因子基因组合，-80℃保存备用；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70-80％融合时将包含Oct4、Sox2和Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液混合液大约5ml分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按1：3常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1×105细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)的6孔培养板上，作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成特制的干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs细胞。