[发明专利]一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法

摘要

本发明涉及“一种快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法”，属于基因工程领域。人工合成一条95bp中间短截片段，克隆到含有目的基因的植物双元表达载体pCAMBIA-1301，转化至大肠杆菌DH5α菌株，再转化至农杆菌EHA105菌株，PCR检测后获得阳性菌株再转化至烟草‘K326’。将获得的阳性植株，进行PCR扩增，根据扩增获得的片段‘SSR-168’和‘SSR-95’电泳条带的亮度比较就可以确定与片段‘SSR-95’一同转入的外源基因的拷贝数。本发明只需采用一对SSR特异引物对转基因植物进行PCR检测，就可以快速检测转基因株系的拷贝数，简单易行，尤其是对插入单拷贝和双拷贝外源基因株系的检测。

主权项

快速检测转基因烟草外源基因拷贝数的方法，其具体步骤如下：1)人工合成序列‘SSR-95’并加入HindIII、SphI酶切位点；2)将步骤1)所述序列‘SSR-95’插入到含有目的基因的植物双元表达载体pCAMBIA-1301的相应酶切位点，转化至大肠杆菌DH5α菌株，PCR检测后，提取阳性菌液质粒，将其转化至农杆菌EHA105菌株，PCR检测后获得阳性菌株；3)将步骤2)所述阳性农杆菌EHA105菌株采用叶盘法转化至烟草‘K326’；4)将步骤3)所述烟草进行GUS染色，获得GUS阳性株系；5)采用常规CTAB法提取步骤4)所述GUS阳性株系的DNA，将其稀释至50-100ng/μl，用引物P-F：5’-TCGGGTCGTTACAACTGATG-3’和P-R：5’-CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3’进行PCR扩增，经2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现两条条带，其中一条为内源SSR片段‘SSR-168’，另一条为外源合成的短截片段‘SSR-95’；当‘SSR-95’亮度低于‘SSR-168’时，则表示与片段‘SSR-95’一同转入烟草基因组的目的基因为单拷贝；当‘SSR-95’亮度高于‘SSR-168’时，则表示转入的目的基因为多单拷贝；当两者亮度一致时，则表示所转入的目的基因为双拷贝。