[发明专利]一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法

摘要

本发明涉及基因组DNA提取方法，具体为一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤：a)DNA的提取；b)DNA的纯化；c)于-20℃下保存备用；d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。通过一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法可提取高质量的能源植物小桐子基因组DNA，并能用于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。

主权项

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，其特征在于：包括以下步骤：a)DNA的提取：先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分擦净；将叶片0.1‑0.2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP‑40)；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65℃预热的4×CTAB抽提缓冲液(4％CTAB，20mM EDTA，3.5M NaCl，100mM Tris‑HCl pH 8.0和2％β‑巯基乙醇)，充分摇匀，再于65℃水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，V V‑1)轻柔混匀并抽提，每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇(24∶1，V V‑1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl(在混合液中达到终浓度为2M)和0.6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2倍体积80％乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10,000转/分钟高速离心15分钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE溶液溶解。b)DNA的纯化：在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37℃处理30分钟以去除RNA；加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀直至形成乳白状混合物；以10,000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL离心管；再用氯仿/异戊醇(24∶1，V V‑1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙醇(NaCl终浓度为2.0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80％乙醇，静置30分钟，以10,000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。c)于‑20℃下保存备用。d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。