[发明专利]一种高纯度耐热β-葡聚糖酶的制备方法

摘要

本发明以本研究室构建的高产耐热性重组Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl为出发菌，对其发酵液进行提取并分离纯化得到电泳纯β-1，3-1，4-葡聚糖酶样品。主要研究冻融法、酶法和超声破碎法破壁对酶活力的影响，考察硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀的特点，最后采用离子交换层析获得了较纯的重组酶，并用SDS-PAGE进行鉴定。重组β-葡聚糖酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析，纯化倍数为22.57倍，回收率为20.06％，最终比活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定表明纯化后的重组β-葡聚糖酶为一单一条带，分子量大小约为27kDa。

主权项

一种制备高纯度耐热β 1，3 1，4 葡聚糖酶的方法，其特征是方法步骤为：1.将重组毕赤酵母划线于YPD平板上进行活化，28℃培养2d，至长出单菌落后接种于10mL BMGY液体培养基中，于30℃，200r/min摇床培养48h，OD600达2～6，3000r/min离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1～2次。2.将菌体用BMMY诱导培养基稀释至OD600＝1，用4层纱布代替棉花塞，于30℃，200r/min摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0.5％(V/V)，诱导3d的后每隔24h从BMMY培养基中取出1mL菌液于1.5mL离心管中，然后补加1mLBMMY于三角瓶中。3.将一定量发酵液置于 20℃冷冻过夜，37℃解冻，离心去除菌体，获取粗酶液A。4.量取一定量的粗酶液A，加入20％的硫酸铵，静置0.5h，4℃，8000r/min离心20min，取上清至另一离心管中，增加硫酸铵的浓度至40％，静置0.5h，4℃，10000g离心30min，弃上清，加入pH 6.5磷酸缓冲液复溶沉淀，得到粗酶液B。5.将粗酶液B装入处理好的透析袋中，置于去离子水中4℃下过夜，中间更换去离子水数次。6.将透析后的酶液上样DEAE 650M离子交换柱(2.6×40cm，0.02mol/L pH6.5NaH2PO4 Na2HPO4缓冲液预平衡，柱体积100mL)，上样量50mL，依次用含0、0.1、0.2mol/L NaCl的0.02mol/L NaH2PO4 Na2HPO4缓冲液(pH6.5)洗脱，2mL/min计时收集。7.取离子交换后精制酶液进行SDS PAGE分析，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，电泳结束后用考马斯亮蓝R 250染色，获得其纯度数据，经相关软件分析，所获酶样品β 1，3 1，4 葡聚糖酶纯度达到90％以上。8.所获高纯度β 1，3 1，4 葡聚糖酶4℃冷藏。