[发明专利]用稀有鮈鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法

摘要

本发明公开了一种用稀有鮈鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法，涉及水体环境污染对水生生物影响的评价。该方法通过检测养殖在不同剂量PBDEs水体中稀有鮈鲫脑组织和性腺组织CYP19b基因的表达量，说明水体中PBDEs的含量越高，类雌激素效应也越明显，从而得到PBDEs类雌激素效应的评价方法。

主权项

用稀有鮈鲫基因表达评价PBDEs类雌激素效应的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：a、设立4个相同环境的养鱼池，在第一养鱼池中放入PBDEs浓度为1ppb的水，在第二养鱼池中放入PBDEs浓度为10ppb的水，在第三养鱼池中放入PBDEs浓度为100ppb的水，在第四养鱼池中放入清水；b、将稀有鮈鲫鱼苗分别放入4个养鱼池中，在相同条件下饲养3-5个月；c、从稀有鮈鲫样本中提取脑组织总RNA；d、将脑组织总RNA，用Invitrogen公司的产品1x反应缓冲液4微升，DTT 2微升，dNTP 1微升，200U RevertidTM H-MMLV逆转录酶1微升，以及脑组织总RNA 3微升，2μmol/L随机引物NNNNNC，N＝A/T/G/C 1微升，水8微升；25℃保温10分钟，42℃反应1小时，将总RNA反转录为脑组织cDNA；e、加入脑组织cDNA 3-5倍体积的水作为反应模板，用Invitrogen公司的产品1x PCR缓冲液1.5微升，0.2μmol/L RT-PCR扩增引物0.6微升，200μmol/L dNTPs 1微升，0.5U Taq DNA聚合酶0.2微升，以及cDNA反应模板2微升，水14.7微升进行RT-PCR扩增，扩增程序：预变性94℃3分钟；重复扩增30个循环，每个循环包括94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒；72℃终延伸5分钟；RT-PCR扩增引物采用F：GCCATCCTGGTGACCCTGTT，R：GGGCTGCCATAGACTCCCAT，得到的产物为脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物；f、在步骤e中RT-PCR扩增引物采用F：TATCCTATTGAGCACGGTATTG，R：CCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的产物为脑组织β-actin基因的RT-PCR扩增产物；g、将脑组织CYP19b基因的RT-PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳，再用溴化乙锭染色，在紫外灯下拍摄两个RT-PCR扩增产物的电泳图，用ImageJ 1.42图像处理软件得到电泳图条带的灰度值；h、在步骤g中脑组织CYP19b基因采用脑组织β-actin基因，得到β-actin基因在稀有鮈鲫脑组织中的表达量；i、从稀有鮈鲫样本中提取性腺组织总RNA，按照步骤d、e和步骤g的方法，其中的脑组织采用性腺组织，得到CYP19b基因在稀有鮈鲫性腺组织中的表达量；j、步骤i中的CYP19b基因采用β-actin基因，得到β-actin基因在稀有鮈鲫性腺组织中的表达量；k、在第一、第二、第三、第四4个养鱼池中分别选取数量相同的稀有鮈鲫样本，按照步骤c、d、f、h和步骤j的方法，对每一条稀有鮈鲫调节步骤e中加入脑组织cDNA的水量，使得所有稀有鮈鲫的β-actin基因在脑组织中扩增的电泳条带灰度值相同，以此确定每条稀有鮈鲫在步骤e中加入其脑组织cDNA的水量；1、加入每一条稀有鮈鲫脑组织cDNA的水量以步骤k为准，再按照步骤c、d、e和步骤g的方法，得到每条稀有鮈鲫CYP19b基因在脑组织中的表达量；m、对步骤k中的稀有鮈鲫样本，按照步骤j的方法，对每一条稀有鮈鲫调节步骤e中加入性腺组织cDNA的水量，使得所有稀有鮈鲫的β-actin基因在性腺组织中扩增的电泳条带灰度值相同，以此确定每条稀有鮈鲫在步骤e中加入其性腺组织cDNA的水量；n、加入每一条稀有鮈鲫性腺组织cDNA的水量以步骤m为准，再按照步骤i的方法，得到每条稀有鮈鲫CYP19b基因在性腺组织中的表达量；o、水体中PBDEs含量越高，用其养殖的稀有鮈鲫在脑组织和性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明类雌激素效应也越明显；稀有鮈鲫在脑组织和性腺组织中的CYP19b基因RT-PCR扩增产物的电泳图条带灰度值越高，表明用其养殖的水体中PBDEs的含量越高。