[发明专利]一种牛乳铁蛋白素的分离方法

摘要

一种牛乳铁蛋白素的分离方法，它涉及一种乳铁蛋白素的分离方法。它解决了现有分离乳铁蛋白素的方法存在分离后得到的乳铁蛋白素纯度低、成本高及安全性差的问题。分离方法：一、制备上清液；二、采用离子交换层析方法分离上清液；三、采用反相层析方法分离，即可分离出牛乳铁蛋白素。本发明分离出的牛乳铁蛋白素经测得纯度高达90％～92％。本发明分离出的牛乳铁蛋白素相对分子量为3124.89Da。本发明工艺简单、设备简单且成本低廉，本发明安全性好。

主权项

一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于牛乳铁蛋白素的分离按以下步骤实现：一、称取4～6g的乳铁蛋白溶于100mL水中，用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.0～3.0，然后加入0.0013～0.002g的胃蛋白酶，而后在温度为37℃的条件下酶解3.5～4.5h，再在温度为75～85℃条件下加热处理10～20min，然后冷却至20℃，滴加NaOH调节pH至7.0，然后在温度为4℃、离心转速为17000g的条件下离心10～20min，收集上清液；二、在温度为25℃条件下，将上清液进行离子交换层析，首先进行淋洗，再进行梯度洗脱，进样量为500μL，在检测波长为215nm条件下收集梯度洗脱第二步的洗脱峰，得牛乳铁蛋白素的粗分离组分，然后放置于截流量为1000Da的半透膜中，在pH值为8.0的超纯水中透析20～30h，脱盐后冻干，得冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分；三、在温度为25℃条件下，将冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分再次进行反相层析分离，进样量为500μL，在检测波长为215nm的条件下收集第二个洗脱峰并冻干，即分离出牛乳铁蛋白素；其中步骤二中梯度洗脱洗脱的方式为先采用第一步洗脱再进行第二步洗脱；其中第一步洗脱为用体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4进行洗脱18min；第二步洗脱为用体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4进行洗脱15min；第一步洗脱与第二步洗脱的洗脱流速为1mL/min；第一步洗脱中体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈，第二步洗脱中体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈；步骤三中进行反相层析分离的方式是先用体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈和体积百分比为80％、体积浓度为0.1％的TFA溶液平衡5min后进样，进样后进行线性洗脱，体积浓度为90％的乙腈的体积百分比在40min内由20％均匀升到50％，其中体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈含体积浓度为0.9％的TFA，洗脱流速为1mL/min。