[发明专利]一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法

摘要

本发明公开了一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法，该方法包括下列步骤：1、将冷冻干燥的生物组织样品磨细，然后加入提取液超声破碎以提取待测物；2、将步骤1所得提取液经强阳离子交换固相萃取柱进行富集，洗脱，然后将洗脱液处理成待测物的水溶液，用于分析测定；3、HPLC-MS联用对待测物定性；4、外标法对待测物进行定量。本发明方法能同时定性和定量检测生物样品中的MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys，检测结果可靠，重现性好，灵敏度高，应用该方法首次检测到了急性染毒鳙鱼体内MC-RR、MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的存在。

主权项

一种生物体内微囊藻毒素及其代谢产物的检测方法，其步骤是：①、称取冷冻干燥的生物组织样品，于碾钵中磨细后置于离心管中，按照0.1mL/mg的比例加入5v/v％的乙酸-EDTA水溶液，其中EDTA浓度为0.01mol/L，于0℃下超声破碎3～5min，然后在12000r/min下离心，移取上清液至干净容器中避光保存，再重复提取两次，合并得溶液I；②、将溶液I加入已预先活化的强阳离子交换固相萃取柱中进行富集，待富集完毕后，依次用2v/v％的甲酸，90v/v％的甲醇淋洗，最后用含15v/v％浓氨水的甲醇溶液洗脱，洗脱液收集于圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，再用100v/v％的甲醇分三次溶解样品并转入离心管，于旋转蒸发仪上蒸干，得到的固体残渣用去离子水溶解并定容，用于分析测定；③、定性分析：HPLC-MS联用，根据MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys标准品的保留时间和特征碎片离子峰的质荷比m/z进行定性；色谱条件：流动相：A为0.05v/v％的甲酸，B为0.05v/v％的甲酸乙腈溶液；流速：0～20.0min为0.2mL/min，20.01～25.0min为0.3mL/min；色谱柱：C18，100mm×2.1mm ID，3.5μm；柱温：40.0℃；样品盘温度：10.0℃；进样体积为10μL；洗脱程序：0min：95v/v％A，5％v/v％B，1.0min：65v/v％A，35v/v％B，17.0min：55v/v％A，45v/v％B，17.5min：30v/v％A，70v/v％B，18.0min：5v/v％A，95v/v％B，20.0min：5v/v％A，95v/v％B，20.01min：95v/v％A，5v/v％B，25.0min：95v/v％A，5v/v％B；质谱条件：电喷雾离子化；正离子模式；喷针电压为4.5KV；透镜电压：MC-RR为55.50V，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys为45.50V；自动增益控制打开；鞘气流速为20个单位；辅助气关闭；毛细管温度均为250℃；④、定量分析：使用外标法，用色谱峰面积定量，配制MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys混合标样系列水溶液，MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys浓度范围均为0.01～2.5μg/mL，在与待测物同样的色谱条件下直接进样，分别以MC-RR，MC-RR-GSH和MC-RR-Cys的浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，由其回归方程对待测样品进行定量。