[发明专利]一种锯缘青蟹呼肠孤病毒的检测方法无效
| 申请号： | 201010028979.5 | 申请日： | 2010-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN101724715A | 公开（公告）日： | 2010-06-09 |
| 发明（设计）人： | 杨季芳;杨继红;张磊;肖樊 | 申请（专利权）人： | 浙江万里学院;华中师范大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人： | 王敏锋 |
| 地址： | 315100 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： |
本发明公开了一种锯缘青蟹呼肠孤病毒的RT-PCR检测方法，其步骤是：A、根据GenBank中锯缘青蟹呼肠孤病毒基因序列，设计引物；B、锯缘青蟹呼肠孤病毒RNA预变性；C、配制RT-PCR反应液；D、RT-PCR扩增；E、扩增产物检测。将扩增的MC片断克隆至 |
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| 搜索关键词： | 一种 锯缘青蟹呼肠孤 病毒 检测 方法 | ||
【主权项】：
一种锯缘青蟹呼肠孤病毒的RT-PCR检测方法，其步骤是：A、根据GenBank中锯缘青蟹呼肠孤病毒基因序列，设计一对锯缘青蟹呼肠孤病毒特异的RT-PCR引物，引物为MC-1：5’-AAG CTGATATAGAATTGG CTA-3’；MC-2：5’-TCG TTA GCG AGA TCC GCA GGA-3’，用这对引物RT-PCR扩增锯缘青蟹呼肠孤病毒RNA产生一个为120个碱基对组成的PCR产物；B、锯缘青蟹呼肠孤病毒RNA预变性方法：取1～3μL锯缘青蟹呼肠孤病毒RNA，加入锯缘青蟹呼肠孤病毒特异的引物MC-1、MC-2各0.5～1μL，并加入终浓度低于7％V/V的二甲基亚砜，90～97℃变性5min后用于下述RT-PCR；C、配制RT-PCR反应液，其组成为：1～3μL锯缘青蟹呼肠孤病毒RNA，锯缘青蟹呼肠孤病毒特异的引物MC-1、MC-2各200～800nmol/L，AMV逆转录酶1～2U，Taq DNA聚合酶1～2U，三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷各100～400μmol/L，1/10体积的10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液；D、RT-PCR扩增，反应热循环条件为：42℃逆转录0.5～1h，94℃2min灭活AMV逆转录酶，再按照94℃1min、42℃2min、72℃3min扩增45个循环，72℃延伸10min；E、扩增产物检测：在上述RT-PCR扩增产物中加入1/5体积的6×DNA电泳上样缓冲液混合均匀，取5～20μL点样在2～3％m/V琼脂糖电泳检测RT-PCR产物，可见一120bp大小DNA条带，即为锯缘青蟹呼肠孤病毒RT-PCR产物。
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