[发明专利]蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法

摘要

一种蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法，属于生物领域。本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法。本发明具有快速、敏感性高、特异性强等优点，可用于快速诊断欧洲蜂幼虫腐臭，尤其对多种病原引起的混合感染的鉴别诊断更为有效。本标准的建立的PCR检测方法，为我国欧洲蜂幼虫腐臭诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，以期达到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂产品质量具有重要意义。

主权项

一种蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法，其特征在于：a、采用CTAB法或者试剂盒法获得欧洲幼虫腐臭病DNA；b、欧洲幼虫腐臭病DNA的浓度和纯度的测定：取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，使A260与A280比值在1.7～2.0之间；c、引物：EFB1：5’-CTT TGA ACG CCT TAG AGA-3’EFB2：5’-ATC ATC TGT CCC ACC TTA-3’EFB3：5’-TTA ACC TCG CGG TCT TGC GTC TCT C-3’；d、采用半巢式PCR扩增方法，根据蜂房蜜蜂球菌16S rRNA基因，设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，所得PCR理论扩增产物片断大小为486bp，此步扩增结果可以对蜂房蜜蜂球菌与其它杂菌进行区分，但却无法对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的粪肠球菌进行区分；进而再以所得扩增产物为模板设计第三条引物EFB3，其位置处于EFB1和EFB2引物中间，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，理论扩增片断大小为276bp，可以特异性对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的肠球菌进行有效区分；最终通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测。