[发明专利]马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法

摘要

本发明公开了马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法。采用PCR-RFLP技术，对MDV-1攻毒的99羽霞烟鸡BLB2基因第2外显子进行PCR扩增，并对其PCR产物进行Alu I、Cai I、Cfr I、Hin1 I、Hinf I和Rsa I限制性内切酶酶切分析，对这6个位点酶切分析初步获得BLB2等位基因纯合型鸡只7羽；通过对这7羽纯合鸡BLB2与BF2基因测序，最终获得BLB2/BF2等位基因纯合型鸡只6羽；结合攻毒结果，认定其中MD抗性个体4羽。本发明建立的方法能检测到MD抗性纯合基因型鸡，并以其为种鸡来繁殖MD抗性鸡，这对从遗传素质上做好MD及相关免疫抑制性疾病的预防和控制具有极其可观的经济效益。

主权项

马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法，其特征在于，采用PCR-RFLP技术，对MDV-1攻毒后的99羽霞烟鸡BLB2基因第2外显子进行PCR扩增，并对其PCR产物进行Alu I、Cai I、Cfr I、Hin1 I、Hinf I和Rsa I限制性内切酶酶切分析，利用对这6个位点酶切分析初步获得BLB2等位基因纯合型鸡只7羽；建立扩增BF2基因的PCR方法，并通过对获得的7羽纯合鸡BLB2与BF2基因测序，最终获得BLB2/BF2等位基因纯合型鸡只6羽；结合攻毒结果，认定其中MD抗性个体4羽，操作步骤如下：1)鸡攻毒试验攻毒病毒材料的准备：取MDV-1感染的鸭胚成纤维细胞培养物，每羽0.3mL腹腔注射10羽1日龄健康鸡，隔离饲养至1月龄左右时，翼下采集抗凝血，分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，利用禽肿瘤病三重PCR反应鉴别诊断技术进行检测，具体如下，MDV引物为：上游引物5’TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG 3’，下游引物5’GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC 3’，REV引物为：上游引物5’AAGTAAGGTGGTACGATCGTC 3’，下游引物5’CTGCTTCATTCAGGTGTTCGCAAT 3’，ALV引物为：上游引物5’CATACTGGAGCCAATGGTT 3’，下游引物5’AATGTTGTACCGAAGTACT3’；引物比例为MDV∶REV∶ALV＝1∶2∶1；PCR反应体系：10×PCR buffer 5μL、25mM MgCL25μL、10mM dNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL。反应循环参数：95℃预变性1min；35个循环：94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min；72℃后延伸8min；产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果只有大小为317bp片断时，可确认MDV-1单一感染，采集鸡翅静脉抗凝血作为攻毒材料；鸡攻毒试验：7日龄时取经病毒蚀斑计数含2500PFU的MDV-1，以0.4ml/羽腹腔注射所有试验鸡，至13周龄结束实验，试验鸡按常规方法分别隔离饲养并做常见疾病的防治工作，记录攻毒后死亡鸡及存活鸡的肿瘤发生及其检测结果；2)鸡PBLs的采集与分离于攻毒后21天每羽2.0～2.5mL采集鸡血，分离PBLs，抽提DNA，于-20℃保存备用；PBLs分离方法：采集鸡翅静脉抗凝血约1.0ml，加入含0.5ml淋巴细胞分离液的离心管中，1,500r/min离心8～10分钟后，血液被分成数层，小心吸出分离液面的浅黄色层，即为所需的PBLs；3)试验鸡MD的确诊用传统的酚/氯仿DNA抽提方法提取鸡PBLs、羽囊、肝脏、脾脏和肾脏等内脏器官组织以及MDV-1细胞培养物的DNA，经禽肿瘤病三重PCR诊断技术检测只有大小为317bp片断时，可确认MDV-1单一感染；4)霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增合成用于扩增BLB2基因第2外显子的引物：上游引物为5’CAGCGT TCTTCTTCTGCGGT 3’，下游引物为5’TCACCTTGGGCTCCACTGCG 3’，扩增片段应为374bp；PCR反应体系：10×PCR buffer 5μL、80％甘油4μL、二甲基亚砜2μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL；反应循环参数：95℃预变性1min，35个循环：94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，72℃后延伸8min；产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为374bp片断一条；5)PCR产物的酶切分析PCR产物分别用限制性内切酶Alu I、Cai I、Cfr I、Hin1I、HinfI和RsaI进行酶切处理；反应体系：10×buffer 1μL，PCR产物5μL，限制性内切酶均为5U，双蒸水补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴消化过夜，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，分析酶切结果并利用表3得到纯合基因型组合的鸡；6)BLB2等位基因纯合型鸡只的确定对在这6个酶切位点所观测的纯合基因型组合的鸡只进行BLB2基因的克隆、序列测定，用2％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，将目的带切下后用DNA纯化回收试剂盒纯化回收；除对PCR产物进行直接测序外，并将同一个样品的2次独立扩增、纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒作为测序模板，每一个克隆最少挑取5个克隆子分别测序；7)BLB2基因序列同源性检索鉴定与比较分析通过美国国家生物技术信息中心网站的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知基因进行序列同源性比较，以鉴定所获得的DNA序列，用DNAstar软件对等位基因第2外显子核苷酸序列和所编码的氨基酸序列进行比对分析，所引用的GenBank数据库中的BLB2基因序列来自白来航鸡3个不同单倍型：MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B21，抗性纯合基因型组合鸡的BLB2基因应与中等MD抗性B6单倍型核苷酸或MD抗性B21单倍型核苷酸同源性较高，而易感抗性纯合基因型组合鸡的BLB2基因应与MD易感型B19单倍型核苷酸同源性较高；8)BF2等位基因纯合型鸡只的确定合成上游引物为5’GCAGAGCTCCATACCCTGCGGTA 3’，下游引物为5’TCTCCTGCCCAGCTCAGCCTT 3’，用于扩增BF2基因第2内含子，第2外显子，第3内含子；用1.5％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，对PCR产物进行直接测序，并将同一个样品的2次独立扩增、纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH6α感受态细胞，提取质粒测序，每一个克隆最少挑取5个克隆子分别测序；PCR反应体系：10×PCR buffer 5μL、80％甘油4μL、二甲基亚砜2μL、10mM dNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL；反应循环参数：95℃预变性1min，35个循环：94℃变性30s、53℃退火15s、72℃延伸60s，72℃后延伸8min；产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为765bp片断一条；9)BF2基因序列同源性检索鉴定与比较分析用经过我们序列测定的BF2DNA序列在美国国家生物技术信息中心网站的BLAST软件上搜索同源序列，以鉴定所获得的BF2基因；使用DNAstar软件对我们获得的BF2等位基因和其它不同单倍型的第2外显子、第3内含子核苷酸序列进行比对分析，所引用的GenBank数据库中的BF2基因序列来自白来航鸡3个不同单倍型：MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B2；抗性纯合基因型组合鸡的BF2基因应与中等MD抗性B6倍型核苷酸或MD抗性B21单倍型核苷酸同源性较高，而易感抗性纯合基因型组合鸡的应与MD易感型B19单倍型核苷酸同源性较高；10)结合MDV-1攻毒结果及BLB2和BF2基因测序结果确定马立克氏病抗性纯合基因型鸡对由BLB2和BF2基因序列测定得到BLB2和BF2纯合基因型鸡只，结合它们攻毒后的发病情况，确定抗性纯合基因型鸡只。