[发明专利]一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法及其应用

摘要

本发明涉及一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法及其应用，属于分子生物学领域。土壤中含有非常丰富的微生物资源，但利用传统的纯培养技术，仅有1％的微生物可被培养，而未能培养的微生物才是土壤微生物多样性的主体，这给微生物的多样性资源开发和利用带来很大的局限。本研究所提供的提取方法使用溶液I、溶液II、醋酸钾和氯化镁移除腐植酸等杂质，能满足不同类型土壤样品的需要，且能得到高质量、大片段并且适合后续克隆实验的DNA，为研究各种环境中土壤(污泥)样品微生物多样性奠定了基础。提取过程无需再纯化，缩减了提取步骤，降低了提取成本。

主权项

一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤：(1)土壤样品预处理：用10mL pH 8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤土壤样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次；(2)裂解细胞：将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液I，37℃水浴10min，然后加入5mL溶液II，65℃水浴1h，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀；上清中加入2.7mL 5mol/L NaCl，混匀，在65℃水浴中放置5min；(3)除去蛋白并沉淀DNA：用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，8000r/min离心；得到的上层水相与等体积的溶液III(13％聚乙二醇8,000，1.6mol/L NaCl)；混合，冰上静置20min；离心10min(10000r/min)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一遍，室温干燥；(4)除去腐殖酸等杂质：干燥后溶于3ml TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)中；加入707μl(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min；沉淀用70％乙醇洗涤后干燥，用90μlTE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70％乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量为：0.15mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，15mg/mllysozym，pH 8.0；所述的溶液II各成分含量为：0.1mol/L NaCl，0.5mol/L Tris-HCl，10％SDS，pH 8.0。