[发明专利]猪流行性腹泻病毒的生产方法

摘要

本发明公开了一种应用生物反应器微载体培养IB-RS-2细胞生产猪流行性腹泻病毒的生产工艺，本发明包涵不同猪流行性腹泻病毒毒株的生产工艺。本发明包括如下技术步骤：(1)选择IB-RS-2细胞作为制苗用细胞系；(2)制苗用细胞的传代与培养；(3)猪流行性腹泻病毒细胞毒种的繁殖；(4)IB-RS-2细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；(5)猪流行性腹泻病毒抗原的繁殖；(6)收获病毒抗原液的处理。本发明可以大量降低生产成本，投入产出比提高6-8倍。而且生产周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

主权项

一种猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择IB-RS-2细胞作为制苗用细胞系；并包括如下步骤：(1)制苗用细胞的传代与培养：取IB-RS-2细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为35-38℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；(2)细胞毒种的繁殖：用病毒培养液将猪流行腹泻病毒种毒按0.5-5％比例接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，至细胞50-100％以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID50和无菌检测，传至病毒TCID50稳定且达到107.5TCID50/mL以上时停止复壮，作为生产种子；(3)IB-RS-2细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：生物反应器按总体积的30％-80％加入无菌细胞生长液，且每升无菌细胞生长液中按3-10g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌30分钟后，取步骤(1)转瓶上生长良好的IB-RS-2细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按1～3×105个/mL的密度接种到反应器中，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养。(4)制苗毒液的繁殖：待观察微载体上细胞长满80％-90％，空球率低于5％，，满球率大于80％，细胞状态良好，且细胞计数结果达到1～3×106个/mL以上进行接毒操作，按0.5-5％比例介入步骤(2)制备好的猪流行性腹泻病毒种毒，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID50；待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液和微载体；(5)收获病毒液的处理：病毒液和微载体经1次冻融后，离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。