[发明专利]一种通过转基因提高菊花抗蚜虫性的方法

摘要

本发明涉及一种通过转基因提高菊花抗蚜虫性的方法，属于生物技术领域。采用编码harpinXoo蛋白的hpalXoo基因和草丁膦抗性的bar基因二元植物表达载体，将hpalXoo基因和bar基因整合到菊花基因组DNA上，经过草丁膦抗性筛选获得抗性转化植株，PCR和基因组southem blot检测阳性获得转基因菊花株系，通过叶片和整株的抗蚜虫生物测定获得抗蚜虫转基因株系。本发明通过转化外源hpalXoo基因并正常转录表达，以及外源hpalXoo基因插入菊花基因组诱导其广谱抗虫信号传导相关基因NPR1表达，来提高菊花的抗蚜性，为利用基因工程技术选育菊花抗蚜虫品种提供新颖而实用的方法。

主权项

一种通过转基因提高菊花抗蚜虫性的方法，其特征在于，1)构建包含hpa1Xoo基因和bar基因的二元植物表达载体，并转化农杆菌LBA4404用HindIII，EcoR I从pBI121-hpalXoo上将hpalXoo连同启动子和终止子一起切下，将hpalXoo基因插入表达载体pCAMBIA3300中，构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpalXoo，再转化到到农杆菌LBA4404中，于-70℃下保存；2)农杆菌LBA4404介导叶盘法转化菊花采用的农杆菌指包含hpalXoo基因和bar基因的二元植物表达载体的LBA4404，用YEB液体培养基培养农杆菌LBA4404；取菊花茎尖组培，取组培瓶苗叶片0.5cm×0.5cm作为转化受体，在预培养培养基中预培养1～2d后浸入备好的农杆菌菌液感染20min，然后放在共培养基上黑暗中共培养2d；寒菊组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌15分钟；预培养培养基：MS；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤6-BA 1mg/L；分化培养基：MS+6-BA 1mg/L+草丁膦PPT 5mg/L+羧卞青霉素Cb 500mg/L；生根培养基：1/2MS+PPT5mg/L+Cb 200mg/L+吲哚乙酸IAA0.2mg/L；3)草丁膦抗性筛选获得抗性转化植株，再通过PCR和基因组southern blot检测阳性获得转基因菊花株系共培养结束后，将叶盘接入含Cb 500mg/L和PPT 5mg/L的筛选培养基中25℃，光照16h/d，2周继代1次，继代筛选培养基：MS+PPT 3mg/L，待绿芽长到2～3cm高后，切下绿芽转入生根培养基中，当根系发达成为完整的植株，经炼苗后移栽至泥炭土直径5cm盆钵，待苗长至20cm移至直径15cm盆钵栽培，获得植株为具有草丁膦抗性T0代转基因菊花；从T0代剪取8cm顶芽或茎段，在12h光照、12h黑暗的25℃温室，扦插灭菌泥炭土，清水常规管理，获得T1代转基因菊花株系；用转基因寒菊T1代叶片总DNA为模板，质粒pBI121-hpalXoo做阳性对照进行PCR扩增，设计了引物，扩增目的基因产物438bp：hpalXoo上游引物为5’-TTCGGATCCATGAACTCTTTGAACACACAATT-3’；下游引物为5’-GGTGAGCTCTTACTGCATCGATGCGCT-3’；PCR程序：95℃5min；35个循环：95℃45s，56℃45s，72℃45s；72℃7min；分子检测筛选获得抗性株系；提取上述抗性株系的基因组DNA，将基因组DNA用EcoR I酶切，酶切体系为EcoR I1μl，基因组DNA 21.5μl，buffer 2.5μl，过夜酶切后1.5％琼脂糖电泳；用虹吸印迹法转移到尼龙膜上进行Southern杂交分析；Genomic Southen blot阳性的植株进一步证明外源基因已经稳定整合到的寒菊植株，即是转基因植株。