[发明专利]鉴别小麦红粒和白粒的分子标记技术

摘要

本发明公开了一种鉴别小麦红粒和白粒的分子标记技术，利用人工合成小麦衍生品种红粒小麦川麦42和四川栽培白粒小麦川W565杂交，构建F2群体用于红粒基因的遗传分析，1015个F2植株被收获用于鉴定籽粒颜色和川麦42红粒基因的遗传分析与分子标记，其中，F2群体中241个白粒单株被选出，构建F2-3家系，用于验证F2的结果；本发明利用SSR分子标记，对人工合成小麦衍生品种川麦42携带的红粒基因进行作图，从而更快速、准确、有效的选择白粒品种、淘汰红粒品种，加快了白粒小麦育种进程。

主权项

一种鉴别川麦42红粒和白粒的分子标记技术，利用人工合成小麦衍生品种红粒小麦川麦42和四川栽培白粒小麦川W565杂交，构建F2群体用于红粒基因的遗传分析，1015个F2植株被收获用于鉴定籽粒颜色和川麦42红粒基因的遗传分析与分子标记，其中，F2群体中241个白粒单株被选出，构建F2-3家系，用于验证F2的结果；其特征在于：该分子标记技术具体步骤如下：(1)DNA提取和SSR标记：苗期取双亲、F2和F2-3幼嫩叶片，利用CTAB法提取DNA；选用小麦3D染色体长臂上SSR引物筛选双亲川麦42和川W565的遗传差异；PCR反应条件、扩增体系如下：15ul体系：1×PCR缓冲液，模板1.5ul，镁离子浓度1.5mM，dNTP浓度0.2mM，引物浓度为0.2uM，rTaq酶1U，加无菌去离子水或ddH2O水至15ul；PCR程序为：1)94℃预变性5min2)降落PCR程序共11个循环每一循环降低1℃94℃，45秒65℃，45秒72℃，45秒3)常规PCR程序30个循环94℃，45秒55℃，45秒72℃，45秒4)最后一步扩增：72℃，10min电泳检测：聚丙烯酰胺凝胶浓度为6％，其中，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝39∶1，每个点样孔内扩增产物的上样量为5-8ul，220V恒压条件下预电泳20min后400V恒压条件下电泳1h后0.1％硝酸银染色10分钟，2％的NaOH和1.5％甲醛显影至条带出现，最后照相保存；(2)性状鉴定：小麦完全成熟时，收获F1种子、F2单株和F2-3家系种子，每一株系取30-40粒种子放在5％NaOH溶液里浸泡过夜，肉眼鉴定籽粒颜色，种子为黑红色的是红粒，为稻草黄色的是白粒；(3)遗传距离计算和连锁图构建：利用双亲具有多态性的引物扫描F2群体中白粒单株，结合鉴定籽粒颜色的结果，通过卡方检验估算F2群体观察值和预期值间分离比的适合度，用Mapmaker3.0计算标记与抗病基因之间的遗传距离，用Kosambi功能计算图距，LOD值为3.0，用Mapdraw绘制遗传图谱；(4)结果1)根据籽粒颜色鉴定，川麦42红粒基因R-D1是显性遗传的，1015个F2植株中有774株红粒、241株白粒，分离比为3∶1，表明川麦42携带的红粒基因受单基因控制；2)8个3D染色体长臂上的SSR引物被用于扫描F2群体中241个隐性单株，根据241个隐性单株SSR基因型和籽粒颜色的表型，构建连锁图，5个SSR引物和红粒基因R-D1紧密连锁，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314两个SSR标记之间，遗传距离分别是2.1、2.5CM。