[发明专利]一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用

摘要

本发明公开了一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用，属于生物技术领域。该基因的cDNA序列及其编码氨基酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.。本发明涉及基因OsSYP71为水稻中首次报道的Qc-SNARE蛋白基因，基因芯片结果和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病的抗病性。因此，OsSYP71可作为目的基因导入植物，提高植物的抗病性。

主权项

水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的基因工程应用，包括：1)总RNA的提取选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子5×104ml-1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱，取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；2)水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的克隆设计两端引物：P1：5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，P2：5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min末端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1；3)植物表达载体的构建根据水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Kpn I和Xba I，P3和P4引物序列为：P3：5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，P4：5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsSYP71的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将OsSYP71克隆到双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。