[发明专利]一种猪产仔数性状的分子标记方法

摘要

本发明涉及一种猪产仔数性状的分子标记方法。本发明方法包括猪基因组DNA的提取、性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子引物设计、体外扩增和基因型检测。本发明首次发现猪性激素结合球蛋白基因，发现第6外显子的多态性与猪产仔数存在着显著相关；并建立了检测第6外显子突变位点的限制性片段酶切多态性检测方法。本发明方法可以用于猪的育种中产仔数性状的辅助选择，可实现种猪的早期选种，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，大大缩短了世代间隔，加快选择进程；该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较短(217bp)，扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。

主权项

一种猪产仔数性状的分子标记方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)采集耳组织样在仔猪出生当天，采取猪的耳缘组织；(2)基因组DNA提取从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA；(3)引物设计在猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子两端设计1对引物，即上游引物和下游引物，其序列如下：上游引物：TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC，下游引物：GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT；(4)聚合酶链式反应A、配制聚合酶链式反应体系由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、浓度为50ng/ul猪的DNA基因组溶液2ul、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5ul，加水17.1ul至终体积25ul；并混合均匀，制得25ul聚合酶链式反应体系；B、聚合酶链式反应条件将25μl聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：①94℃预变性4分钟，②94℃变性30秒，③退火温度63℃30秒，④72℃延伸30秒，⑤重复第②～④步骤35个循环，⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存，得到猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物；(5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测由于猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子第17位碱基由A突变为G，导致了一个Aval限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是：取猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物10ul于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入10U/ul Aval限制性内切酶1ul，Aval限制性内切酶缓冲液2ul，加水7ul，混匀，温度37℃反应3小时，得到酶切产物；将酶切产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时，电泳条件：常温，电压120V，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，GG型个体为产仔数性状优良基因类型，选择其中条带为GG型的个体留种，可提高选留群体的产仔数。