[发明专利]O157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌及疫苗

摘要

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及基因工程疫苗，属于生物制药领域。分别扩增出EHEC O157:H7的志贺毒素1和2的B亚基(Stx1B和Stx2B)、转位紧密素受体(Tir)，依次串联，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，而后将霍乱弧菌封闭小带毒素(zot)串联其后，即获得重组质粒pGEX-4T-1-2b-tir-1b-zot，在BL21(DE3)获得高效表达。经过高密度发酵和一系列的纯化程序获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获得目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体在体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫方面产生高效的免疫应答，免疫预防保护和治疗作用。

主权项

肠出血性大肠杆菌O157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌，其构建方法为：根据GenBank中O157:H7 EDL933 Tir基因序列、Stx1和Stx2基因序列分别设计引物，引物序列如下：Stx2b‑P1：5’‑ttagaattcgcggcggattgtgctaaag‑3’，Stx2b‑P2：5’‑tcagtcgacattattaaactgcacttca‑3’Tir‑P1：5’‑ggcgtcgacactcttaacaggcagattgg‑3’Tir‑P2：5’‑atcaggcgtcgccagttttcgatgaagcgc‑3’Stx1b‑P1：5’‑gcgcttcatcgaaaactggcgacgcctgat‑3’Stx1b‑P2：5’‑cgcctcgagaacgaaaaataacttcgct‑3’将过夜培养O157:H7培养物，分装1mL/管，12000r离心2min，倾去上清，收集菌体沉淀重悬于1/5体积的双蒸水，沸水煮10min，4℃12000r离心10min后吸取上清冻存‑20℃，用于PCR扩增用；用于扩增Stx2b片段的引物上下游分别加有BamH I和Sal I酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃1min，54℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；扩增Tir和Stx1b片段采用SOE方法进行PCR产物拼接，其中Tir上游和Stx1b下游分别加有Sal I和Xho I酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃1min，60℃30s，72℃1.0min，共30个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水为阴性对照；根据GenBank登陆的zot序列，合成911核苷酸，其中包括位于N端和C端各一个Xho I酶切位点，克隆于pUC57载体中；Stx2b‑P1和Stx2b‑P2、Tir‑P1和Tir‑P2、Stx1b‑P1和Stx1b‑P2扩增片段分别为210bp、891bp和207bp，其中Tir‑P1和Tir‑P2扩增片段位于整个ORF的274‑1176核苷酸之间；Stx1b‑P1和Stx1b‑P2、Stx2b‑P1和Stx2b‑P2扩增片段分别位于62‑268和55‑264核苷酸之间，均截去信号肽序列，分别位于1‑61核苷酸和1‑54位核苷酸之间；将扩增PCR产物用质量比1.5％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE‑A buffer后65℃作用10min，待胶全部融化后，再加入DE‑A buffer的0.5体积的DE‑B buffer，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入W1 buffer500ul，12000g离心30s～60s，再弃液体，加入W2 buffer 750ul，12000g离心1min，弃液体，空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul Elutionbuffer，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的230bp、891bp和238bp片段，命名为stx2b、tir和stx1b片段；而后用Tir‑P1和Stx1b‑P2为上下游引物，以回收的PCR产物tir和Stx1b为模版，用SOE方法扩增出tir‑stx1b串联片段；将BamH I和Sal I酶切的stx2b片段1ul与同样酶切的载体pGEX‑4T‑1片段6ul，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.0ul，双蒸水1.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Sal I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条230bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX‑4T‑1‑stx2b重组质粒；用Sal I和Xho I酶切tir‑stx1b片段和pGEX‑4T‑1‑stx2b阳性重组质粒，胶回收后各取4.0ul，T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1.0ul，一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI和Xho I、Sal I和Xho I分别进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以分别1359bp和1129bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX‑4T‑1‑stx2b4ir‑stx1b重组质粒；将pGEX‑4T‑1‑stx2b‑tir‑stx1b和pUC57‑zot用Xho I单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化处理，4℃连接，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I进行单酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选正向插入的zot片段，有1493bp条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX‑4T‑1‑stx2b‑tir‑stx1b‑zot重组质粒，将测序正确的阳性质粒pGEX‑4T‑1‑stx2b‑tir‑stx1b‑zot转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21(pGEX‑4T‑1‑stx2b‑tir‑stx1b‑zot)。