[发明专利]菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用

摘要

本发明公开了菊花NAC类蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用，属于生物技术领域。DlNAC的cDNA序列见SEQ ID NO.1。DlNAC是定位于细胞核内的转录因子，mRNA表达分析表明该基因为组成性表达，在幼叶中的表达量最高，并且DlNAC的表达受干旱、高盐和高温胁迫的诱导。将构建的植物表达载体35S:DlNAC转化烟草获得过量表达DlNAC的转基因烟草，与未转基因烟草相比其耐盐性、耐热性和耐旱性都得到显著提高，表明该基因可作为目的基因导入植物，提高转基因植物的综合耐逆性。

主权项

菊花蛋白NAC基因DlNAC的基因工程应用，包括：1)菊花NAC基因DlNAC的克隆根据菊花NAC基因DlNAC的全长序列，设计两端引物：上游引物：5′-CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3′下游引物：5′-TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3′以甘菊(Dendranthema lavandulifolium)的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列SEQ ID NO.1；2)植物表达载体的构建根据菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入Xba I限制性内切酶位点，下游引物引入BamH I限制性内切酶位点：上游引物：5′-gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3下游引物：5′-cgggatccGTTTAAGAAAT TAAGCAT-3′以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADS1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；3)转基因植株的获得将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株EHA105，进一步转入植物烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价：将T1代烟草转基因植株和对照植株种子消毒后，播种在含有100mM NaCl的1/2MS培养基上正常光照培养20天，处理后表现明显优于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因植株；在1/2MS培养基上生长28天的T1代转基因植株和非转基因对照于45℃热胁迫处理30h后，移至25℃恢复生长14天，恢复明显优于对照组的植株即为耐热性增强的转基因植株；耐旱性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有0.3M甘露醇的1/2MS培养基上，正常光照培养20天，处理后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株。