[发明专利]花粉辐射诱变创制梨S基因纯合体新种质的方法

摘要

本发明涉及花粉辐射诱变创制梨S基因纯合体新种质的方法，属于分子遗传学领域。通过Co60γ40Gy诱变剂量辐射‘黄花’和‘丰水’梨花粉，再进行人工自花授粉，共从自交后代株系筛选鉴定出S1基因纯合体植株7株、S2基因纯合体植株4株、S3基因纯合体植株3株、S5基因纯合体植株2株。这些S基因纯合体的植株为今后为梨倍性育种、花粉与雌蕊相互识别的细胞信号转导、S基因时空表达特性及其蛋白产物的功能验证等方面的研究提供了很好的试材，并可在田间授粉上起指导作用，具有良好的理论研究价值和生产应用前景。

主权项

花粉辐射诱变创制梨S基因纯合体新种质的方法，其特征在于：将采集好的‘黄花’、‘丰水’梨花粉用Co60γ射线进行辐射处理，辐射剂量40Gy，辐射时间15min，各重复2次，处理当日即对去雄的‘黄花’、‘丰水’进行人工自花授粉，套上硫酸纸袋，授粉后25d调查花序坐果率，每花序留1～2个果，种子成熟后采果并取出种子，育苗；根据梨S-RNase基因的保守序列，用Primer premier 5.0软件设计正反向通用引物：PF 5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′PR 5′-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′扩增两自花授粉后代株系的基因组DNA，检测梨S-RNase基因的扩增技术体系：反应体系总体积为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL 3.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，各引物0.1μM，20-50ng模板，Taq酶1.0U；通用引物PCR所用程序为：94℃预变性2min，94℃15s，48℃30s，72℃3min，10个循环后，94℃变性15S，48℃退火30S，72℃3.5min，25个循环后72℃延伸7min；在‘黄花’花粉诱变自交后代的株系中，若只能扩增出一条S2-RNase的1347bp带型，则说明该株系为S2S2的纯合体，若只能扩增出一条S1-RNase的367bp带型，则说明该株系为S1S1的纯合体；在‘丰水’花粉诱变自交后代的株系中，均可扩增出一条384bp的扩增片段，用AlwNI酶切扩增产物，AlwNI酶切技术体系为：15μl反应体系中，10×Buffer R 1.5μl，Cail 0.5μl，PCR产物7.5μl，ddH2O5.5μl，酶切反应条件：37℃环境下反应12h～14h；若酶切后带型为121bp和263bp两条带型，则对应该株系为S5S5的纯合体；若酶切后依然是一条384bp的带型，则说明该株系为S3S3的纯合体，从而获得纯合的S基因种质。