[发明专利]一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法

摘要

一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，它涉及一种厌氧细菌的分离方法。本发明解决了现有分离同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的方法分离周期较长、不易获得纯菌株的问题。方法：一、提取DNA、PCR扩增；二、分离培养、纯化培养和富集培养；三、PCR扩增；四、分离培养、纯化培养和富集培养；五、PCR扩增；六、分离培养、纯化培养和富集培养即得到同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌。本发明的分离方法，与现有厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌的分离方法相比，周期缩短了40%~50%，工作量小，周期短；本发明的分离方法得了目的菌株的纯菌株，且对硝酸盐和亚硝酸的降解效果好。

主权项

一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，其特征在于同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行PCR扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5'‑ AC[C/G]CACTGGAAGCACG‑3'，下游引物为5'‑TGCCGAGGAGAACGATGTC‑3'，第一套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、56℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min，PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L 的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E和2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为5'‑ TCACACCCCGAGCCGCGCGT‑3'，下游引物为5'‑AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG‑3'，第二套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min， PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E、2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品和20μL的dH2O组成。