[发明专利]一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法。该方法操作按以下步骤进行：1)样品RNA的提取，2)cDNA的合成，3)snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7，4)snPCR第一轮扩增产物的克隆、序列测定，5)snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7。本发明与现有技术比较的有益效果是：建立和利用快速鉴定马立克氏病(MD)抗性/易感单倍体的半巢式PCR(snPCR)法，可以简单、快速、方便地鉴定MD抗性/易感单倍体，进而鉴定出MD抗性鸡个体。

主权项

一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法，其特征在于，该方法操作按以下步骤进行：1)样品RNA的提取无菌翅静脉采集鸡血，分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，按产品说明书方法使用Trizol RNA抽提试剂盒提取上述组织的总RNA；2)cDNA的合成取RNA样品14.5μL，加入25pm BF基因外下游引物1μL，引物序列为5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，70℃5min，置于-20℃5min；然后加入5μL 5×RT-Buffer，2μL 10mM dNTP，200U M-MLV逆转录酶，25U Rnasin并混匀，37℃放置1h，96℃作用5min，最终得25μL cDNA，保存于-20℃备用；3)snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7设计一对外引物：外上游引物5`-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3`，外下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，用于扩增BF基因的第6外显子、第7外显子、第8外显子以及3`非翻译区3`-UT的编码外显子，PCR反应体系：10×PCR buffer 5μL、10mM dNTP 1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL，反应循环参数：95℃预变性5min，35个循环：95℃变性30sec、61℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min，产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，扩增结果如仅有195bp片段的单倍体，初步定为抗性单倍体；扩增结果如有195bp和162bp片段的单倍体，初步定为易感单倍体；4)snPCR第一轮扩增产物的克隆、序列测定对鸡的PBLs第一轮snPCR扩增产物进行克隆、序列测定：用1.5％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒DNA测序，所有目的带测序结果应为BF基因的相应片断；5)snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7设计一对内引物：内上游引物5`-TACAACATTGCGCCCGGG-3`，内下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，内上游引物序列为第6外显子末端15个碱基和第8外显子前3个碱基，因此，它恰好只能结合前面提到的162bp片断，而不能结合前面提到的195bp片断，PCR反应体系：10×PCR buffer 5μL、10mM dNTP 1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL。反应循环参数：95℃预变性5min，35个循环：95℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min。产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，扩增结果为阳性，即有141bp片段的单倍体，定为易感单倍体；扩增结果为阴性，即无141bp片段的单倍体，定为抗性单倍体，此个体即相应地的为MD抗性鸡。