[发明专利]一种重复模块基因拼接方法

摘要

本发明涉及一种重复模块基因拼接方法，包括：(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；(2)双酶切PCR产物和质粒pET-LIC，片段与载体相连接，转化感受态细胞后得到质粒pET-TS；(3)双酶切质粒pET-TS并回收质粒片段，然后与目的基因片段进行连接转化，得到质粒pET-TS2；(4)双酶切pET-TS2并回收质粒片段，然后与目的基因片段进行连接转化，得到质粒pET-TS3；(5)双酶切上述质粒及目的基因PCR产物，利用相同的方法将重复片段不断的插入。本发明对多个重复模块基因的重复拼接，且这些模块之间没有任何的酶切位点残基保留，真正实现重复模块之间的“无缝”连接，且此拼接具有方向性。

主权项

一种重复模块基因拼接方法，包括：(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；引物设计必须符合以下条件：向5’添加重复序列：上游引物：5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切酶识别位点+目的基因5’端完全匹配的碱基20～30个-3’；下游引物：5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切酶识别位点+NNNN目的基因3’端完全匹配的碱基20～30个-3’；其中，N为目的基因的5’端起始的4个碱基；N的个数与所选用的IIS限制性内切酶的粘性末端个数相同；向3’端添加重复序列上游引物：5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切酶识别位点+NNNN+目的基因5’端完全匹配的碱基20～30个-3’；下游引物：5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切酶识别位点+目的基因3’端完全匹配的碱基20～30个-3’；其中，N为目的基因的3’端末尾的4个碱基；N的个数与所选用的II S限制性内切酶的粘性末端个数相同；(2)分别利用两个II型限制性内切酶对PCR产物和质粒pET-LIC进行双酶切，PCR产物酶切后片段与质粒载体相连接，转化感受态细胞后得到质粒pET-TS；其中，切割PCR产物所用的两个II型限制性内切酶与扩增该产物所用引物中的两个II型限制性内切酶相同；(3)向5’端或3’端添加目的基因序列：利用II型和II S型限制性内切酶双酶切目的基因PCR产物并回收酶切后片段，同时利用II型限制性内切酶和II S型限制性内切酶双酶切质粒pET-TS并回收载体质粒片段，然后进行连接转化，得到质粒pET-TS2；(4)向5’端或3’端添加目的基因序列：利用II型限制性内切酶和II S型限制性内切酶双酶切目的基因PCR产物并回收酶切后片段，利用II型限制性内切酶和II S型限制性内切酶双酶切pET-TS2并回收载体质粒片段，然后进行连接转化，得到质粒pET-TS3；其中，步骤(3)或(4)中向5’端添加，切割PCR产物所用的II型限制性内切酶与载体中待重复目的片段5’上游的II型酶相同，II S型限制性内切酶与载体中待重复目的片段5’的II S型酶酶切粘性末端互补，且切割质粒所用的II型限制性内切酶与切割PCR产物所用的II型限制性内切酶相同；向3’端添加，切割PCR产物所用的II型限制性内切酶与载体中待重复目的片段3’下游的II型酶相同，II S型限制性内切酶与载体中待重复目的片段3’的II S型酶酶切粘性末端互补，且切割质粒所用的II型限制性内切酶与切割PCR产物所用的II型限制性内切酶相同；(5)双酶切目的基因PCR产物及上一步骤连接的质粒，利用相同的方法将片段不断的插入到质粒中，且此插入方法具有方向性，完成基因的重复拼接。