[发明专利]一种微生物柴油的制备方法

摘要

本发明公开了一种微生物柴油的制备方法。该方法以富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂为原料，首先分离纯化出更具价值的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，剩余脂肪酸制备微生物柴油，它包括微生物油脂的制取、混合脂肪酸的制备、分离、纯化多不饱和脂肪酸及剩余脂肪酸制备微生物柴油。本方法在生产微生物柴油的同时，生产出更具价值的功能性脂肪酸，以提高微生物柴油的综合经济效益，使得合成工艺更具经济竞争性。

主权项

一种微生物柴油的制备方法，以高产脂微生物菌种在一定的培养条件下通过发酵培养制得富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂，并以富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂为原料，首先分离纯化出更具价值的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，剩余脂肪酸制备微生物柴油，其特征在于通过下列方法制取：微生物油脂的制取：微生物发酵培养完成后，将发酵液离心收集菌丝体，菌丝体沉淀按每克菌6mL的比例加入4mol/LHCl，振荡混匀，室温放置30min后，沸水浴3min，-20℃速冷，加入2倍体积氯仿∶甲醇(1∶1)提取液，充分振荡后，5000r/min离心5min，取氯仿层，加等体积0.1％NaCl溶液，混匀，5000r/min离心5min，取氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，即得微生物油脂；混合脂肪酸的制备：在微生物油脂中加入37％NaOH-乙醇溶液，置标准磨口圆底烧瓶，在80℃水浴中回流皂化2h，得皂化液，室温冷却后，加适量水使皂完全溶解，用10％HCl酸化至pH2-3，加正己烷萃取，分层，去下层水层，水洗上层至中性，加无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收正己烷，即得混合脂肪酸；分离、纯化多不饱和脂肪酸：可采用尿素包合法，尿素中加入95％乙醇，在磁力搅拌器上搅拌，待全部溶解后加入混合脂肪酸搅拌均匀，按照混合脂肪酸：尿素∶乙醇＝1∶3.5∶10.5(w/w/w)混合比例热回流40min，室温冷却，于-5℃冰箱放置20h，减压抽滤，滤液加入适量正己烷，用10％HCl酸化至pH2-3，加入适量水，充分萃取，分离有机相，用正己烷多次萃取水相，合并有机相，水洗至中性，用无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收有机溶剂，得到富集后的多不饱和脂肪酸(PUFAs)；剩余脂肪酸制备微生物柴油：脂肪酸10-100g，加入甲醇2.0-50g，加入浓硫酸1.0-3.0wt％作催化剂，酯化反应温度控制在60-100℃，反应2-6h，减压蒸馏回收过量的甲醇，即得微生物柴油；斜面培养基(PDA)配方：马铃薯浸出液20％，琼脂1.8％，葡萄糖2.0％，自然pH；初筛平板培养基配方：马铃薯浸出液20％，琼脂1.8％，葡萄糖2.0，自然pH；种子培养基配方：玉米淀粉4.0％，葡萄糖2.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO4 0.01％，酵母膏0.1％，尿素0.1％，pH6.4-6.7；发酵产脂培养基配方：碳源为葡萄糖45-100g/L，氮源为(NH)2S040.5g/L，KH2PO41.0g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO41.0g/L，柠檬酸三钠2.0g/L，pH 6.0。