[发明专利]兔膝关节软骨单位体外酶解消化获取的实验方法

摘要

本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种兔膝关节软骨单位体外酶解消化获取的实验方法。其步骤如下：留取兔膝关节，将关节软骨反复剪成碎片组织，冲洗，弃上清，放置于无菌锥形瓶备用；采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，搅拌，消化，形成消化悬液；将消化悬液过滤、离心，加入原代软骨细胞培养液，制成无菌的软骨单位悬液。本发明的有益效果：获取方法简单，重复性好；更加符合软骨细胞在体内的生长环境及生物学特性；软骨单位较单纯细胞相比生物力学特性明显提高，改善了软骨细胞作为种子细胞生物力学特性较差的缺点。

主权项

一种兔膝关节软骨单位体外酶解消化获取的实验方法，其特征在于步骤如下：(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重，放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为0.3％的dispase酶和质量/体积浓度为0.2％的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0.22μm一次性过滤器过滤、除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37℃5％CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；(3)将上述消化悬液用100μm细胞筛网过滤于离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，然后10mL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL，原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清1mL，制成无菌的软骨单位悬液。