[发明专利]1万亿活芽胞每克地衣芽胞杆菌原粉的制备方法

摘要

本发明公开了一种1万亿活芽胞每克地衣芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤：A.筛选菌种BL KN-08的发酵培养基，采用Box-Behken发明的响应面方法设计实验，以芽胞数为筛选指标，得到一个有利于提高芽孢数的培养基配方；B.提高发酵生物量，通过响应面法筛选的培养基配方进行分批发酵，确定有利于产芽胞的最优发酵工艺，并通过分批补料发酵进一步提高芽孢数；C.芽胞提取与回收；由该工艺生产的地衣芽胞杆菌原药具有生产清洁安全、回收率高、产品芽孢数稳定、产品活芽胞数达10,000亿活芽胞每克等优点。

主权项

一种1万亿活芽胞每克地衣芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是：A.BL KN-08的培养基配方筛选：采用Box-Behken发明的响应面方法设计实验，以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验首先从碳源、氮源、微量元素因子中选择因子筛选设计，采用多元一次和二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过回归方程设计培养基B-52，发酵液芽胞数为75亿cfu/ml；(1)、碳源因子：通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出玉米粉、大米粉和玉米淀粉为BL KN-08碳源需求因子；(2)、氮源因子：通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵中筛选出酵母粉、豆粕和玉米浆为BL KN-08氮源需求因子；(3)、微量元素因子：微量元素因子：通过单因子实验，从氯化钴、碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌中筛选出磷酸二氢钾、氯化锰和氯化钠为BL KN-08微量元素需求因子；(4)、利用PB实验设计筛选影响BL KN-08芽胞形成的因子，试验表明大米粉、酵母粉和玉米浆对BL KN-08芽胞的形成有影响，通过最陡坡试验确定大米粉用量为15.26g/L，酵母粉用量为27.05g/L，玉米浆用量为16.58g/L，通过SAS统计软件设计中心组合实验，最终得到BL KN-08发酵配方B-52，芽胞数达到75亿：大米粉15.26g/L，酵母粉27.05g/L，玉米浆16.58g/L，豆粕3.88g/L，玉米粉4.16g/L，玉米淀粉3.95g/L，磷酸二氢钾0.68g/L，氯化锰0.2g/L，氯化钠2.5g/L；B.提高发酵生物量：采用BL KN-08发酵配方B-52进行分批发酵，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH值、芽胞数为指标，确定营养平衡，及与芽胞数关系，在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度15g/ml，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度为0.5-1.0％质量比，发酵过程共用葡萄糖7％质量比；，发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围，发酵液活芽胞数达106亿/ml；C.芽胞提取与回收：发酵罐酸化，2N稀盐酸，pH4.2-4.5，升温35-37℃，80-85目过滤，加3.5‰质量比硫酸锌，搅拌3-8分钟，再加2.5‰质量比黄血盐，搅拌1-2分钟，静置15-30分钟，离心去上清，菌浆加3倍体积的水水洗后二次离心，得到菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-201℃，出口风温85-87℃，原药活芽胞数达10,000亿/克。