[发明专利]一种质粒提取纯化柱的回收方法

摘要

本发明涉及一种物品的回收方法，尤其涉及实验用的质粒提取纯化柱的回收方法。目前常见的质粒大量抽提方法有：PEG沉淀法、溴化乙锭-氯化铯梯度离心法以及试剂盒法，其中试剂盒法较前两种方法快速并且提取的纯度高。然而，因其是一次性产品，价格昂贵，这又成为人们不得不考虑的问题。本发明一种质粒提取纯化柱的回收方法，具体如下：步骤1，质粒DNA的制备。步骤2，质粒DNA的纯化。步骤3，纯化柱再生。步骤4，鉴定回收是否彻底。步骤5，质粒DNA的纯度、含量测定及鉴定。本发明实现了质粒提取纯化柱更彻底的回收方法，避免了由于再生不彻底所造成的质粒交叉污染现象。使质粒提取纯化柱得以再生至少10次，成本降低至原价的1/10。

主权项

一种质粒提取纯化柱的回收方法，其方法如下：步骤1，质粒DNA的制备。按常规方法挑选已构建并经鉴定的anti‑senseTSK质粒进行转化、涂板，每瓶200ml摇菌、收菌。然后采用碱裂解法，用试剂P1(EDTA、DNA抑制酶)10ml悬浮菌后混合摇匀，‑20度保存。使用时取出后先解冻0.5小时，至菌液变为液体时两管中各加入P2(NaOH∶SDS∶纯水＝1∶1∶8)10ml轻微摇匀几下后放置几分钟至裂解充分(菌液呈半透明)，然后加入P3(乙酸钾)10ml摇动使混匀，此时产生大量白色蛋白沉淀，放置冰中15分钟后再用力振荡至混匀，平衡后5000rpm离心30分钟后取上清液。步骤2，质粒DNA的纯化。取纯化柱，30mLQBT液平衡柱床，然后将步骤1制取的上清液加入到纯化柱内。待上清液完全流经柱体后，加20mLQC液洗柱两次。15mLQF液洗脱DNA至放有0.7倍体积(10.5ml)异丙醇的管中，放置‑20度中过夜。第二天取出，两管平衡后5000rpm离心30分钟后用吸去上清。400ul70％乙醇洗涤沉淀三次至1.5ml离心管中，12000rpm离心10分钟，吸去上清后室温干燥沉淀，最后用水溶解质粒DNA所形成的沉淀。步骤3，纯化柱再生。对纯化柱做好标记，每次大抽回收时分别用1M HCl(方法1)、3MNaCl(方法2)，30ml/次洗脱上述使用过的纯化柱两次，然后分别浸泡在盛有1M HCl、3M NaCl的管中封口膜封口，浸泡24‑48h，再次使用时用去离子水(MQ)30ml/次，洗涤五次至流出液为中性。再用QC液30ml/次，过柱一次(洗脱蛋白等杂质)。QBT液30ml/次，过柱一次(平衡柱子)。步骤4，鉴定回收是否彻底。采用PCR、电泳法：再次使用纯化柱时，当再次做大量抽提质粒前使纯化柱过QF液各两次，按上述收集质粒方法各收集两次后与之前收集的质粒(稀释到50ng/ul)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳法比较看是否含有质粒。步骤5，质粒DNA的纯度、含量测定及鉴定。紫外分光光度仪测定两方法回收的柱子每次提取的样品DNA的OD260/OD280比值：水溶后的样品取6ul加入到594ul灭菌水中，稀释100倍后拿到紫外分光光度仪测定OD值，根据1ug/ul＝OD260值×5，将质粒稀释至1ug/ul，再根据加水体积即总体机，算产量(产量＝浓度×体积)。