[发明专利]一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法

摘要

本发明涉及一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，提供一种高产油酸的酵母工程菌株，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，含有千年桐VeSAD基因，可以改变产油酵母脂肪酸成分从而提高油酸含量，该方法的步骤如下：(1)含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得；(2)VeSAD正义表达载体构建；(3)重组农杆菌菌株获得；(4)浅白隐球酵母工程菌株的获得。本发明有益的效果是：本发明将从千年桐种子总RNA中分离的VeSAD基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300上，并采用农杆菌介导法将VeSAD基因导入浅白隐球酵母，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表达，增加了浅白隐球酵母的产油率，特别是提高了油脂中油酸的含量。

主权项

一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：在酵母基因组中含有千年桐VeSAD基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeSAD序列、终止密码子，其中所述的酵母是浅白隐球酵母；该方法的步骤如下：(1)、含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得根据千年桐VeSAD基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT‑PCR扩增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位点，下游引入Kpn I酶切位点，电泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T‑Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM‑T‑sad；(2)、VeSAD正义表达载体构建结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、SalI、Pst I，选用Sal I、Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带Sal I、Kpn I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM‑T‑Vesad为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I双酶切；分别回收相应的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞；提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300‑sad；(3)重组农杆菌菌株获得采用冻溶法将重组表达载体pCAM2300‑sad农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL‑1；(4)浅白隐球酵母工程菌株的获得采用农杆菌介导法，活化含重组表达载体的农杆菌，与浅白隐球酵母菌液共培养，转移到含卡那霉素的筛选培养基上，获得具有卡那霉素抗性的转化子，经PCR和Southern分子鉴定，表明千年桐VeSAD基因已经插入浅白隐球酵母的基因组中。