[发明专利]拟南芥花青素pap1纯化蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种拟南芥色素调控蛋白基因的克隆、原核表达与蛋白纯化，拟南芥花青素pap1纯化蛋白及其制备方法和应用。本发明利用RT-PCR技术从拟南芥紫红色叶片中克隆pap1全长cDNA，然后再利用原核表达系统将该基因在大肠杆菌BL21中进行表达，然后采用镍柱法纯化，获得拟南芥PAP1的纯化蛋白。拟南芥花青素pap1纯化蛋白在制备Myb抗体中的应用和拟南芥花青素pap1纯化蛋白在Myb蛋白表达检测中的应用。

主权项

拟南芥花青素pap1纯化蛋白，由下述方法制备而得：(1)根据NCBI已报道序列(NM_104541.3)的完整阅读框架，设计引物PAP1‑T5′(5CCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3′，划线处为酶切位点NcoI)和PAP1‑T3′(5′CTCGAGCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC3′，划线处为酶切位点XhoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核表达研究，分别在PAP1‑T5′和PAP1‑T3′的5′端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥紫红色叶片总RNA为模板，用M‑MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1‑T5′和PAP1‑T3′进行扩增；(2)回收pap1全长片段，并将其连接到pMD18‑T载体上，采用碱裂解法提取质粒，通过酶切检测获得重组质粒pMD18‑pap1；(3)构建原核表达载体：使用NcoI和XhoI对质粒pMD18‑pap1和pET32a‑xyk进行双酶切分别获得pap1基因和pET32a载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16℃连接16h，获得原核表达载体pET32a‑pap1；(4)PAP1蛋白原核表达：使用热刺激法将pET32a‑pap1转入大肠杆菌BL21中，在IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAP1蛋白纯化：收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。