[发明专利]高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法

摘要

本发明涉及一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，目前还没有试剂用量少，检测成本低，检测灵敏度高的该类检测方法。本发明包括标准溶液制备、蜂王浆样品处理、标准曲线制作和蜂王浆样品检测工序；蜂王浆样品处理工序中，用2％的HClO4以去除蜂王浆样品中的蛋白质及其他极性化合物，用1mol/L的NaOH将上清液的pH值调到8.8使其中的有机酸和醇溶蛋白盐化，提高极性防止被乙酸乙酯提取；最后将检测样液用高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得硝基咪唑类药物的残留量。本发明试剂用量少，检测成本低，检出限为：甲硝唑0.03μg/kg、洛硝哒唑0.06μg/kg和二甲硝咪唑0.03μg/kg。

主权项

一种高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法，其特征在于：该方法所用到的原料包括纯度＞99.4％的甲硝唑，纯度＞99.0％的洛硝哒唑，纯度＞98.5％的二甲硝咪唑，纯度＞98％的D3-二甲硝咪唑，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氢氧化钠和氯化钠，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈、乙酸铵和甲酸，水，初始流动相；所述初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为3∶97；该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为550℃，辅助加热气为65.00psi，干燥气为65.00psi，气帘气为10.00psi，碰撞气为5.00psi，电喷雾电压为4000.00V，离子化法为正离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Intersil ODS C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl；该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序；所述标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准液配制步骤：称取10mg甲硝唑、10mg洛硝哒唑和10mg二甲硝咪唑均置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为1000mg/L的混合贮备标准液；b、混合中间标准液配制步骤：取a中的混合贮备标准液100μl置于10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml配制成浓度为10mg/L的混合中间标准液；c、二甲硝咪唑氘代内标配制步骤：称取D3-二甲硝咪唑10mg用乙腈配制成浓度为10mg/L的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液；d、临时标准使用液配制步骤：取b步骤中的混合中间标准液分别用水配制成浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液、浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液，取c步骤中的二甲硝咪唑氘代内标中间溶液用水配制成浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液；所述蜂王浆样品处理工序如下：a、称取蜂王浆样品10g加入10ml水并混合均匀而制得蜂王浆样品液；b、将a中的蜂王浆样品液置于一号50ml离心塑料瓶中，再向一号50ml离心塑料瓶中加入浓度为100μg/kg的二甲硝咪唑氘代内标临时使用液100ul并混合充分，然后静置5min以上；再向一号50ml离心塑料瓶中加入30ml体积浓度为2％的HClO4混合均匀并提取5min，然后将位于一号50ml离心塑料瓶中的液体在常温下超声破乳1-2min，再用体积浓度为2％的HClO4定容至50ml而制得蜂王浆混合液；将蜂王浆混合液置于30℃下进行超声提取20min，然后在转速为3000rpm下离心5min而得到上清液；取上清液20ml置于二号50ml离心塑料瓶中，并用浓度为1mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值调节到8.8，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入2.0g氯化钠，待氯化钠溶解后再加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min后，在转速为3000rpm下离心2min而得到乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中并在35℃下进行氮气吹干，然后向15ml塑料离心管中加入1ml初始流动相并进行超声溶解，再向15ml塑料离心管中加入2ml正己烷并用力振摇充分混合去脂，然后在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；所述标准曲线制作工序中，先称取6份重量均为10.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶、五号试剂瓶和六号试剂瓶中；然后向一号试剂瓶中加入10ml水并混合均匀而制得一号阴性蜂王浆液，向二号试剂瓶中加入100μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得二号阴性蜂王浆液，向三号试剂瓶中加入500μl浓度为10μg/kg的三号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得三号阴性蜂王浆液，向四号试剂瓶中加入1000μl浓度为20μg/kg的二号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得四号阴性蜂王浆液，向五号试剂瓶中加入500μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得五号阴性蜂王浆液，向六号试剂瓶中加入1000μl浓度为200μg/kg的一号临时标准使用液和10ml水并混合均匀而制得六号阴性蜂王浆液；然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液、五号阴性蜂王浆液和六号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液，该一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液的系列浓度为0μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、2μg/kg、10μg/kg和20μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液、五号标准液和六号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；所述蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测得蜂王浆中硝基咪唑类药物的残留量；该方法的检测定量限为甲硝唑0.1μg/kg、洛硝哒唑0.2μg/kg和二甲硝咪唑0.1μg/kg。