[发明专利]一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用，在构建外源性表达载体pPIC-Rpf的基础上，将其转化毕赤酵母制备重组子，经过抗性筛选得到分泌Rpf蛋白的毕赤酵母重组子。该毕赤酵母表达系统能够持续分泌具有生物活性的Rpf蛋白，该蛋白能够促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和结核分枝杆菌H37Ra的生长，促进临床TB病人痰标本中MTB的生长，可用于临床TB的快速诊断。

主权项

一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以包含Rpf基因的载体或基因组为模板，以引物对P为引物，PCR扩增Rpf基因；所述的引物对P为：上游引物P1：gcctcgagaa acgagaggct gacaccatga ctctcttcac  40；下游引物P2：tagcggccgc tcaggcctga ggcaggacga gctcc       35；2)将PCR扩增的Rpf基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化片段；并将该线性化片段与被XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接得到重组酵母表达载体pPIC-Rpf；将重组酵母表达载体pPIC-Rpf转化到感受态的毕赤酵母，筛选得到整合了目的基因的阳性转化子；3)将阳性转化子在BMGY培养基中30℃、200r/min条件下培养，当OD600达到2.0～6.0时，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬进行诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，30℃、200r/min条件下继续培养96～120h后收集培养上清液；4)将收集的培养上清液通过层析分离纯化得到Rpf因子。