[发明专利]一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法

摘要

本发明提供的一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法，将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制剂milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养6-9小时，用不含有milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时；脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，移至洗涤液内，捡出排出第一极体的卵母细胞，统计极体排除率即成熟率；将排出第一极体的卵母细胞用5μMol/L离子霉素激活4-5分钟，洗涤液洗涤1-3次，再用2-3小时前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6-甲氨基嘌呤激活2-3小时，用2小时前在CO2箱平衡好的培养液洗涤3-4次，入培养液内培养48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率即可。另将染色分离获取的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时直接利用。该法对绵羊卵母细胞体外利用有重大的实用价值。

主权项

一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法，其特征在于：将染色分离获取的质次BCB‑卵母细胞，用含有50‑100μMol/L的PDE3抑制剂milrinone的成熟培养液洗涤2‑3次，培养6‑9小时，用不含有milrinone的成熟培养液洗涤2‑3次，培养至24小时；脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，移至洗涤液内，捡出排出第一极体的卵母细胞，统计极体排除率即成熟率；将排出第一极体的卵母细胞用5μMol/L离子霉素激活4‑5分钟，洗涤液洗涤1‑3次，再用2‑3小时前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6‑甲氨基嘌呤激活2‑3小时，用2小时前在CO2箱平衡好的培养液洗涤3‑4次，入培养液内培养48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率即可；其中BCB‑卵母细胞的获取：摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30‑35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3‑4次；用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2‑8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35‑60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为25‑30μMol/L的BCB染色液，至于35‑39℃水浴中染色80‑90分钟；在显微镜下将BCB+和BCB‑卵母细胞分离；其中染色分离的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2‑3次，培养至24小时，直接利用即可；其中实验液体的配制：抽卵液：TCM199‑hepes+1mg/ml PVA+0.7mg/ml肝素钠；亮甲酚蓝染色液：26μMol/L亮甲酚蓝+PBS+5mg/ml BSA；含有milrinone的成熟培养液：50‑100μMol/L milrinone+TCM199‑HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；成熟培养液：TCM199‑HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；洗涤液：10％FBS+90％TCM199‑hepes；SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；培养液：SOF+3mg/mlBSA；离子霉素：5μMol/L离子霉素+1％二甲基亚砜+10％胎牛血清+89％TCM199‑hepes；6‑甲氨基嘌呤：2mMol/L 6‑甲氨基嘌呤+1％二甲基亚砜+10％胎牛血清+89％TCM199‑HCO3。