[发明专利]一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法

摘要

一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明在水相或有机/水双相反应体系中，利用重组菌无细胞提取物催化不同底物芳基酮，获得光学纯芳基醇，产物光学纯度为90％～100％e.e.，产率为50％～90％。通过添加10～20g/L辅助底物，初始辅酶0.005～0.2mM NADP+，实现反应必需辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为936～3604。反应时间由全细胞催化体系的12～48h缩短至2～12h。与常规纯酶或全细胞催化方式不同，该无细胞系统不需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，同时缩短反应时间，而且该系统还适用于其他的醇脱氢酶和羰基还原酶，是一种具有广泛适用性的经济、方便、有效的生物催化系统。

主权项

一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，其特征在于以重组菌无细胞提取物为催化剂，并在该无细胞体系中添加辅助底物和初始辅酶NADP+实现辅酶NADPH的再生循环，同时催化芳基酮不对称转化反应制备光学纯芳基醇；所用的辅助底物选用葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，浓度为10～20g/L；辅酶NADPH初始添加量为0.005～0.2mM；所用的底物芳基酮选用2-羟基苯乙酮、间氯-2-羟基苯乙酮、对氯-2-羟基苯乙酮、对甲基-2-羟基苯乙酮、对甲氧基-2-羟基苯乙酮、间氯-2-溴苯乙酮、对氯-2-溴苯乙酮、对甲基-2-溴苯乙酮、对甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、邻氯苯乙酮、间氯苯乙酮、对氯苯乙酮、对甲基苯乙酮、或对甲氧基苯乙酮，浓度为10～80mM；(1)重组菌的构建提取基因组的菌种为近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组DNA作为PCR扩增反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的引物1和含有XhoI限制性酶切位点的引物2通过PCR反应扩增scr1基因片断；引物1：5′-CCCGCCCGCATATGAGTAAAGACGAAACAATTTC-3′，引物2：5′-GCCCGCTCGAGTGGGACAGTATAACCACCATC-3′，PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，1μL 50pmol/μL引物1，1μL 50pmol/μL引物2，基因组DNA 5μL，5U/μLTaq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应过程为：94℃预变性5min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；利用限制性内切酶NdeI和XhoI对扩增得到的scr1基因与载体pET21c进行双酶切处理，处理后DNA片断插入载体pET21c的NdeI和XhoI位点获得带有目的基因片断的重组质粒pETSCR1，重组质粒pETSCR1转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pETSCR1)；(2)重组菌无细胞提取物的制备LB培养基，以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，氨苄青霉素0.05，固体培养基添加琼脂粉15；挑取重组菌单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.1～1mmol/L，在培养温度17～30℃下诱导培养12～15h；培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min，并用生理盐水洗涤三次后收集细胞；菌体重新悬浮于pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液中配置成含有湿细胞浓度为100g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液总可溶蛋白浓度5～20g/L作为无细胞提取物用于不对称转化反应；(3)重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇(a)水相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应2mL反应体系组成：1mL pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液，1mL无细胞提取物，提取物的总可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL辅助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP+；反应混合物于20℃振荡反应2～12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；或(b)有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应2mL反应体系组成：0.6mL pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液，0.4mL有机溶剂，1mL无细胞提取物，提取物的总可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL辅助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP+；反应混合物于20℃振荡反应2～12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；反应有机相所用有机溶剂为乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、辛醇、二甲苯、或异丙醚。