[发明专利]一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术

摘要

本发明公开了一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术，属于植物脱毒与组培快繁技术领域。该方法包括(1)培养基的配制；(2)根尖脱毒与快繁；(3)紫马铃薯试管苗或试管微型薯的复合病毒感染多重RT-PCR同步快速检测等步骤。该发明依据紫马铃薯的特点，对各级培养基作了调整，并改传统的茎尖脱毒为根尖脱毒，简化了操作程序，避免了高污染率，提高了工作效率，且接种体分化好，试管苗繁殖速度快，脱毒彻底，微型薯长势好，月增殖率达到4-6倍，其生根率和移栽成活率达98％以上。本发明可在紫马铃薯适宜地区推广应用。

主权项

一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术，其特征在于按以下步骤进行：(1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含的重量为：1)基本培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO350mg/L+KH2PO4500mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7-9g/L，pH 5.6-5.8；2)根尖诱导培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.5-1mg/L+NAA0.3-0.7mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；3)增殖培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.2-0.5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；4)继代生长培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/0.5L+BA0.2-0.5mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；5)生根培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；6)微型薯诱导培养基：采用马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+6BA0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；(2)根尖脱毒与快繁：1)材料预处理和根尖外植体的选取、灭菌：将紫马铃薯种薯放入灭菌细沙内于37土2℃下进行热处理6-12周至抽生出根系；取1-2cm长主根根尖，经70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴土温摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，在显微镜下将前端长0.1-0.2mm的根尖切下作为外植体，备用；2)根尖诱导再生植株培养：将外植体接种在步骤(1)2)根尖诱导培养基上，在25土2℃、光强1000lux、光照16小时/d下培养，至四周后其余条件不变光强增强到2000lux，六周后增强到4000lux，八周后减弱到1500lux下继续培养直至从根尖诱导出再生植株幼芽，此阶段总共需培养3.5-4.5个月；3)幼芽增殖培养：将幼芽接种在步骤(1)3)增殖培养基上，在25土2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/d下培养1个月至长成8-10cm长小苗；4)继代生长培养：将小苗剪成2-2.5cm长小段接种在步骤(1)4)继代生长培养基上，在25土2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/d下培养至长成8-10cm长小苗；以后每隔3-4周按同上工艺进行一次继代扩繁，直到满足苗数要求；5)生根培养：将继代扩增小苗接种到步骤(1)5)生根培养基上，在25土2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/d下培养，1周后长出根系成为完整试管苗；6)试管微型薯的培育：将长高至8-10cm的试管苗，剪成带有1-2个叶片和腋芽的茎段，按每瓶5-6个茎段接种至装于三角瓶内的步骤(1)6)微型薯诱导培养基上；在22℃、黑暗条件下培养10-15天始形成微型薯，相同条件下继续培养6-8周后即可收获微型薯；(3)紫马铃薯试管苗或试管微型薯的病毒检测：1)紫马铃薯病毒ssRNA的制备：选取紫马铃薯马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)及马铃薯S病毒(Potato Virus S，PVS)的叶片、叶梗、茎干或马铃薯块茎为材料，放入100mL0.5Triton X-100 0.4％Na2SO3的病毒浸提液中；置37℃浸提20min，室温浸提1h后取上清液；经12,000r/min离心机离心10min后，取上清液保存于-20℃，备用；2)cDNA合成：根据马铃薯病毒CP基因序列设计出马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)及马铃薯S病毒(Potato Virus S)的特异性引物对；cDNA合成每个反应总体积为10μL，反应试剂包括病毒总RNA 2.5μL，1×MMLV，含3mmol/L MgCl2缓冲液，1.5mmol/L dNTPs，2.5U RNA酶抑制剂，50U MMLV反转录酶MMLVRT，0.5μmol/L反义引物；反应程序为25℃温育10mim，42℃反转录45mim，95℃灭活2mim；所述的马铃薯病毒特异性引物对为：PVS上游引物P1：5‘-ATGCCGCCCAAACCGGATCCGTCA-3’PVS下游引物P2：5‘-TCATTGGGTGATTGCATTACGGTG-3’PVY上游引物P3：5‘-GCAAATGACACAATCGATGCAGGA-3’PVY下游引物P4：5‘-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’PVX上游引物P5：5‘-GAGCACAACACAGACCACAG-3’PVX下游引物P6：5‘-GACTAGTTATGGTGGTGGGAGAG-3’PLRV上游引物P7：5‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA-3’PLRV下游引物P8：5‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT-3’；3)PCR扩增：PCR反应总体积为25μL，取4μL反转录合成的cDNA作为PCR反应模板；多重PCR的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，3.5mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶2U，0.5mmol/L特异性引物对；扩增程序为94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min；其中PCR反应中所加引物的体积比例为PVX∶PVY∶PLRV∶PVS＝0.4∶0.5∶0.9∶1.0；4)观察电泳条带：以电泳条带对照、确立紫马铃薯试管苗或试管微型薯有否感染相应病毒。