[发明专利]大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28 K的RNAi植物表达载体

摘要

本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。分别改造植物载体pBI121和pCAMBIA3301，并连接得到新载体pGSB。PCR扩增CHAS内含子片段，并用其替换载体pGSB中GUS序列，分别设计引物扩增Gly mBd 28K正义和反义干扰片段，并将其分别引入载体pGSBI，得到Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体pYZ。Gly m Bd 28K是大豆主要过敏蛋白质之一，该RNAi植物表达载体转化大豆将会对过敏蛋白质基因进行基因沉默，为确保过敏人群食用大豆安全奠定坚实基础。对提高我国大豆分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。

主权项

大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体，其构建方法为：1)pBI121的nos序列的改造设计引物P1、P2，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Asc I位点的nos终止子片段，上游引物P1：5` AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA 3`下游引物P2：5` GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC 3`PCR扩增产物连入pMD19 T simple vector中，测序验证；设计引物P3，与下游引物P2，以含Asc I位点的nos终止子片段为模板，扩增得到含Sac I和Asc I两个酶切位点的nos片段，上游引物P3：5` CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA 3`PCR扩增产物连入pMD19 T simple vector中，测序验证，得PMD nos；质粒pMD nos和质粒pBI121分别EcoR I/Sac I双酶切，回收pMD nos中的小段和pBI121的大片段后连接，得到中间载体pBI121 nos；2)pBI121的GUS序列的改造设计引物P4、P5，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Pac I位点的GUS片段，上游引物P4：5` CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA 3`下游引物P5：5` CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC 3`PCR扩增后，连入pMD19 T simple vector中，测序验证；设计引物P6，与上游引物P4，以含Pac I位点的GUS片段为模板，扩增得到上游含Xba I和Pac I两个酶切位点的GUS片段，上游引物P6：5` CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT 3`PCR扩增产物连入pMD 19 T simple vector中，测序验证，得pMD GUS；质粒pMD GUS和质粒pBI121 nos分别Sac I/XbaI双酶切，回收pMD GUS中的小片段和pBI121 nos中的大片段后连接，得到载体pBI121 nos GUS；3)质粒pBI121 nos GUS和质粒pCAMBIA3301分别EcoR I/Hind III双酶切，回收pBI121 nos GUS的小片段和pCAMBIA3301的大片段连接，得到载体pGSB；4)将CHAS内含子序列连入载体pGSB选用‘南农32’作为材料，取幼嫩叶片，按照TaKaRa公司提供的基因组DNA提取试剂盒说明书要求，提取大豆叶片基因组DNA；设计引物F1、F2，以基因组DNA为模板，获得含酶切位点的CHAS片段，上游引物F1：5` CCTTAATTAA GTGTAAGAATTTCTTATGTTACA 3`下游引物F2：5` CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA 3`PCR扩增产物连入pMD19 T simple vector中，测序验证，得pMD CHAS；质粒pMD CHAS和质粒pGSB分别Sac I/Pac I双酶切，回收pMD CHAS的小片段和pGSB的大片段，连接得到载体pGSBI；5)Gly m Bd 28K干扰片段的获得选用‘南农32’作为材料，取幼嫩荚果，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据NCBI上公布的GenBank：AB046874.1大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 28K的序列信息设计特异引物，进行常规聚合酶链式PCR反应，分别扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列SEQ IDNO.13和反义序列SEQ ID NO.14，扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列引物：上游引物R1：5` CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT 3`下游引物R2：5` TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT 3`扩增Gly m Bd 28K干扰片段的反义序列引物：上游引物R3：5` GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG 3`下游引物R4：5` CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT 3`PCR扩增产物分别连入PMD19 T simple vector中，测序验证，得pMD 28S和pMD 28A；6)Gly m Bd 28K RNAi植物载体的构建pMD 28A与pGSBI分别Pac I/XbaI双酶切，回收pMD 28A的小片段与pGSBI的大片段连接，得到含反义片段的载体pGSBI 28A；pMD 28S与pGSBI 28A进行Sac I/Asc I双酶切，回收pMD 28S的小片段与pGSBI 28SA的大片段连接，得同时含Gly m Bd 28K正义和反义片段的RNAi植物表达载体pYZ，Xba I/Asc I双酶切验证，构建成功。