[发明专利]一种鉴别牦牛肉干产品肉种来源的三重PCR-RFLP方法

摘要

快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法属于分子生物学检测领域，可用于牦牛肉干产品的来源追溯和物种成分的快速鉴别。它解决了目前牦牛肉、黄牛肉和水牛肉鉴别方法准确性低等缺陷，提供了一种牦牛肉、黄牛肉和水牛肉准确鉴别的PCR-RFLP方法。可将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别：提取样品DNA，采用通用引物扩增和凝胶电泳检测，然后利用HgaI、ApaI和PflMI限制性内切酶进行同步酶切和PCR-RFLP分析，即可快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉。本发明采用PCR-RFLP方法，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。

主权项

一种快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法，其特征在于可以把牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法鉴别：(1)1.5mL离心管中加入约100mg样品，用剪刀剪碎，加200μLTE溶液(pH 8.0)，旋涡混匀；(2)加入400μL裂解液，旋涡混匀；(3)加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(4)取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(5)取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(6)取上清液，加0.8倍体积异丙醇，12000rpm离心10min；(7)弃上清液，收集DNA，接着取70％乙醇清洗1次，再将其室温下自然干燥；(8)加100μLTE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后将其-20℃保存以备用。(9)PCR扩增及检测：用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上游引物F：5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R：5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL，其中10×PCRBuffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：95℃变性10min，95℃变性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环后再72℃继续延伸7min。取4μLPCR产物与1μL 6×loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2％琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片段的PCR产物7μL，然后依次加入HgaI、ApaI和PflMI三种限制性内切酶各0.5μL，NEB buffer 2.5μL，ddH209μL，37℃温浴3h。酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断：HgaI把牦牛样品酶切割为220bp和252bp，ApaI把普通牛样品酶切割为173bp和299bp，PflMI把水牛样品酶切割为69bp和403bp。