[发明专利]人源S100A4蛋白的基因优化与高效表达

摘要

本发明公开了一种人源S100A4蛋白的基因优化与高效表达的方法。本发明根据大肠杆菌偏好密码子，通过设计并合成优化人源S100A4序列的引物，以设计的引物互为模板，PCR扩增获得了能高效表达的优化人源S100A4基因，并与表达载体连接，在大肠杆菌中实现了高效表达。

主权项

权利要求1所述的人源S100A4蛋白的基因优化与高效表达，其特征在于包括如下步骤：(1)人源S100A4序列的优化设计与引物合成：①根据大肠杆菌偏好密码子，利用Condonopt密码子优化软件优化从GenBank中检索到的S100A4基因序列；②全部选用偏好密码子，设计合成S100A4序列的引物。③为了便于蛋白表达，在两端引物分别引入了Nde I和Xho I的酶切位点。(2)PCR合成优化后S100A4序列PCR法合成。(3)表达载体pET32a‑S100A4的构建①以人源S100A4基因全长片段为模板，以pfu酶进行PCR扩增引入酶切位点。②用Nde I、Xho I双酶切S100A4纯化后的PCR产物，所得产物与pET32a质粒连接并转化到表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，PCR筛选阳性转化子。(4)在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行高效表达①将阳性单克隆菌，接种于5mL含氨苄西林的LB培养基中，37℃，160r/m过夜培养。②次日将过夜培养的菌液按1∶50的比例重新转接400mL的LB(含Amp)培养基中。30℃条件下，160rpm振荡培养3h后，加入1mol/L的IPTG溶液1.2ml，继续振荡培养4‑5h后，以8000rpm收集菌体，用PH为7.4，0.2mol/L PB溶液重悬菌体后加入一定量的EDTA溶液，进行超声破碎菌体。超声破碎条件：功率200W，超声处理30s，间隔20s，循环50次。③破碎后，4℃ 8000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。