[发明专利]一种多引物直接退火构建RNA干扰载体的方法

摘要

本发明提出了一种多引物直接退火构建RNA干扰载体的方法，主要包括：载体的改造、寡核苷酸序列的退火以及退火产物克隆到RNAi载体三部分。该方法不需要合成长度大于50nt的寡核苷酸引物序列，不需要进行PCR、酶切回收小分子DNA以及连接酶处理等操作，而是依靠线性载体与退火产物各自突出的粘性末端在大肠杆菌体内的连接产生重组质粒。该方法简便快捷，经济直观，筛选方便，准确率高。

主权项

一种多引物直接退火构建RNA干扰载体的方法，其特征在于具体步骤为：一)载体的改造首先选定一目标载体，按照传统的分子克隆操作方法，在目标载体中插入“启动子‑限制性核酸内切酶酶切位点1‑填充片段‑限制性核酸内切酶酶切位点2‑终止子”序列，该插入序列中启动子和终止子将负责含有siRNA、shRNA或者amiRNA的RNA分子的转录；序列中的限制性核酸内切酶酶切位点1和2相同，或者不同；二)寡核苷酸序列退火根据siRNA、或者shRNA或者amiRNA前体分子的DNA序列组成，设计一组能相互退火的引物，将这些引物等浓度混合，并让其相互退火，退火产物的5’末端有13Nt左右、能与线性载体末端互补的突出碱基；三)线性化载体与退火产物的直接转化将步骤一)中改造好的载体经限制性核酸内切酶1和2酶切成线性DNA分子后，用具有3’→5’外切酶活性的T4DNA聚合酶、或者大肠杆菌DNA聚合酶I、或者Klenow DNA聚合酶处理该线性DNA载体分子，得到具有5’端突出的线性DNA，当限制性核酸内切酶为切口酶则不需要3’→5’外切酶活性处理，然后将该线性DNA载体分子与步骤二中得到的退火产物混合后直接转入大肠杆菌感受态细胞，通过填充片段能显示的表型的消失筛选出含有RNA干扰载体的重组子，最后通过测序鉴定RNA干扰载体序列的正确性。