[发明专利]转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应（PCR）检测方法

摘要

转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应（PCR）检测方法，涉及对转红色荧光蛋白基因唐鱼特异的检测方法。根据外源的红色荧光蛋白基因序列设计了一对特异性扩增红色荧光蛋白基因的引物，经过优化反应体系和反应条件，认为退火温度64℃为最适的退火温度，以转红色荧光蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板扩增出一条487bp的片段，以野生型唐鱼基因组DNA为模板进行扩增，没有扩增产物。本检测方法可早期鉴定转红色荧光蛋白基因唐鱼，甚至小鱼在出苗前就可以进行检测；检测速度快；在检测时可以设阳性对照（以含有红色荧光蛋白基因的质粒pDsRed-mylz2为PCR模板）和阴性对照（以水为模板），所以检测结果十分准确，成本低。

主权项

转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应（PCR）检测方法，其特征是：（一）引物的设计根据红色荧光蛋白基因序列设计并合成引物如下：P1：5' GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGT 3'P2：5' CTACAGGAACAGGTGGTGGCGG 3'以转红色荧光蛋白基因唐鱼基因组DNA为模板预期扩增片段487bp，以野生唐鱼基因组DNA为模板预期无扩增片段出现；（二）模板DNA的提取（1）取待检测的整个唐鱼鱼苗或唐鱼的肌肉组织剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用；（三）PCR反应体系ddH2O 20μL10×PCR Buffer 2.5μL4×dNTP（10mmol/L） 0.5μLTaq酶（5U/μL） 0.2μLP1 （10μmol/L） 0.4μLP2 （10μmol/L） 0.4μL模板DNA 1.0μL（四）PCR反应条件94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7分钟；（五）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶（含荧光染料）中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相。