[发明专利]小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测技术

摘要

本发明属于小麦谷粒中禾谷镰孢菌(Gibberella zeae，无性态Fusarium graminearum)的定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测方法，专门用于特异性测定麦粒中禾谷镰孢菌侵染量。该法先建立禾谷镰孢菌的实时定量PCR检测的标准曲线，然后对待测麦粒提取DNA，进行实时定量PCR反应，根据所建立的标准曲线获得待测样品中该病原菌侵染量。整个过程只需6h，检测准确率达99％以上；具有快速、简便、准确、灵敏的特点，可用于更加科学地评估麦粒赤霉病病害严重度及有关防治技术的实际效果。

主权项

小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real‑time quantitative PCR)技术检测谷粒中禾谷镰孢菌菌丝的侵染量。谷粒中禾谷镰孢菌检测方法，共分三步：第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取实验室培养的禾谷镰孢菌菌丝DNA和待测谷物样品DNA。第二步：运用禾谷镰孢菌特异性DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，建立禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线。实时定量PCR反应体系及其扩增条件：禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线反应体系：dH2O(灭菌蒸馏水)                           9.5μLPlatinumTM SYBR Green qPCR SuperMix‑UDG    12.5μLTr5F(10μM)                                0.5μLTr5R(10μM)                                0.5μLROX Reference Dye                          1μLDNA模板                                    1μL                                                      总体积                                     25μL扩增条件：预热：        50℃    2min预变性：      95℃    2min              ↓变性：        95℃    15s退火：        60℃    30s延伸：        72℃    45s35个循环              ↓最后一步延伸：72℃    5min熔解温度：    59℃第三步：待测样品完成实时定量PCR反应后，应用第二步中已经建立好的标准曲线，计算出待测样品中禾谷镰孢菌的菌丝量。