[发明专利]一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法

摘要

本发明阐述了一种产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，属于生物技术领域。取经分离纯化的乳酸菌，接种于MRS培养基中，待菌体生长达到稳定期时，离心收集菌体，采用全细胞催化，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为唯一底物，以醋酸-醋酸钠为缓冲体系，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h，利用产GAD乳酸菌含有的谷氨酸脱羧酶使L-谷氨酸或L-谷氨酸钠发生脱羧作用生成γ-氨基丁酸，然后通过纸层析分析反应体系中是否含有γ-氨基丁酸来筛选产γ-氨基丁酸的乳酸菌，并通过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析对所产γ-氨基丁酸的菌株进行鉴定。本发明的方法可以大大提高功能性益生菌的定向筛选效率。

主权项

一种产γ‑氨基丁酸乳酸菌的筛选方法，其特征为：1)乳酸菌的富集培养选择富含乳酸菌食品新鲜牛奶、发酵乳制品、发酵肉制品、发酵蔬菜制品或发酵谷物为富集样品，加入到脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，25～40℃静置培养24～48h，富集培养液；2)乳酸菌的初步分离纯化取上述富集培养液进行10梯度倍比梯度稀释成10‑4、10‑5、10‑6的稀释菌液，涂布于MRS平板上，于30℃培养48h，挑取肉眼可见、生长较快、单个有溶钙圈的菌落分离并纯化，根据菌落特征进行初步归类，将革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株作为进一步筛选的乳酸菌疑似菌株，并将其编号、保存；3)产γ‑氨基丁酸乳酸菌的筛选将上述分离纯化后的菌种接种于MRS培养基中，待菌体生长达到稳定期时，离心收集菌体，加入0.5～3倍培养液体积的灭菌生理盐水洗涤菌体2～4次，取湿菌体0.1～1g，悬浮于5～50mL含有5～100mM的L‑谷氨酸或L‑谷氨酸钠溶液的0.2mol·L‑1醋酸‑醋酸钠缓冲体系中，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～24h，反应结束后，将混合液离心后，取上清进行纸层析分析，所述的纸层析分析方法为，展开剂组成：正丁醇∶冰乙酸∶水体积比＝4∶1∶3，内含质量浓度为0.4g/100mL的茚三酮，以GABA标准品做参比，待测样品点样5μL，采用新华一号层析纸展开后于90℃下烘干显色20min；4)产γ‑氨基丁酸乳酸菌的判断如果纸层析分析反应体系中存在与GABA标准品相对迁移率Rf一致的茚三酮显色斑点，则含有γ‑氨基丁酸，即为即为筛选得到产γ‑氨基丁酸的乳酸菌。