[发明专利]一种溶水性VI人胶原蛋白多肽的制备方法

摘要

本发明提供了一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法。将VI人胶原蛋白多肽编码基因连入克隆载体，转化大肠肝菌，构建工程菌，诱导工程菌表达VI人胶原蛋白多肽，分别建立工程菌发酵和目的蛋白纯化工艺。经过蛋白质电泳分析和活性鉴定后，表明VI型人胶原蛋白多肽分子量为46kDa，可溶于上清，具有良好的水溶性，以单体或多聚物形式存在；在体外能保护细胞免受紫外线伤害，消炎及滋润保湿作用。本发明实现了规模制备一种溶水性VI人胶原蛋白多肽的基因工程制备方法。

主权项

一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤和条件如下：I.以含有人COLVIA2 mRNA基因序列的质粒pCMV‑SPORT6为模板，应用PCR克隆出溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因(1)从含有质粒pCMV‑SPORT6的大肠杆菌中制备质粒DNA：遵循Omega公司的质粒提取试剂盒的说明书来提取制备；(2)根据基因库编号BC065509.1的人类胶原蛋白VIA2型全长mRNA序列，设计带酶切位点ECORI，SalI的上下游引物如下：P1 COL6A2ECORI为5’atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3’P2 COL6A2SalI为5’atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3’PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃再延伸7min；PCR反应体系为：5×PS buffer 10μL；dNTP 2μL，其中，dATP、dGTP、dTTP、dCTP的浓度均为2.5mM；P1 1μL，其浓度为10μM；P2 1μL，其浓度为10μM；Taq DNA polymerase  2U；COLVIA2 mRNA200ng；加水至反应总体积为50μL；其中，Taq DNA Polymerase简称Taq酶，是TAKARA的DNA聚合酶；dNTP为三磷酸脱氧核糖核苷，包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP；所用试剂为TAKARA的DNA Polymerase试剂盒里的试剂；经PCR获得目的基因，用1.2％(g/mL)浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化后得到溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因；上述含有人COLVIA2 mRNA氨基酸序列的质粒pCMV‑SPORT6为‑80℃条件下保存；克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因序列如下：GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAGCCCGGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGGAGACCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCGGCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGATCCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGGAGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCTGTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAACTTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGTGGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCAAGGAGGCTGTCAAGAACII.将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因经过ECORI和SalI限制性酶处理后并连入表达质粒pET‑32a，获得重组载体(1)用Omega公司的质粒提取试剂盒抽提质粒载体pET‑32a，用限性内切酶ECORI和SalI分别对纯化好的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因和质粒载体pET‑32a进行双酶切；溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因双酶切反应体系是：溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因30μL，10×PS buffer 5μL，ECORI2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h；质粒载体双酶切反应体系是：pET‑32a 30μL，10×PS buffer5μL，ECORI 2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h；反应结束，用Omega纯化试剂盒纯化酶切产物，分别用20mL的ddH2O回溶；(2)将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因与质粒pET‑32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应1至3h，得到重组载体；III.将重组载体质粒转入到大肠杆菌宿主菌中筛选阳性克隆和测序鉴定将重组载体转化到大肠杆菌DH5α感受态，转化方法如下：将重组载体15μL加入到大肠杆菌DH5α感受态菌μL中，混匀，冰浴30min；然后42℃热休克90s，再迅速转移至冰上2min，然后升温至37℃；将反应菌液涂在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上，恒温37℃条件下培养8小时；挑选阳性克隆至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rmp过夜培养；然后提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果分析显示，插入片段的氨基酸序列与Genebank上收录的COLVIA2 mRNA氨基酸序列完全一致；IV.转染大肠杆菌宿主细胞后诱导表达和分析取测序后正确的重组质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有氨苄的LB固体培养基中37℃培养8h，随机挑取单菌落转至氨苄的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β‑半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，28℃下诱导7h后收集菌液进行SDS‑PAGE电泳分析，结果表明在相对分子量46kDa处有明显特异性条带，与预期的VI型人胶原蛋白多肽相对分子量相符，并且该蛋白为水溶性蛋白；VI型人胶原蛋白多肽序列如下：GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPKGDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKGEPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCGCCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEKNFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDSLSS FKE AVK N所述的VI型人胶原蛋白多肽，其分子量为46kDa，氨基酸组成为250个，线性多肽单链；V.重组表达载体转染大肠杆菌宿主细胞后得到工程菌，工程菌的培养基和培养条件培养基成份为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6.5‑7.0；培养条件：培养温度37℃，pH 6.8，转速为150r/min，接种量为每100mL的LB液体培养基接种4mL菌液，氨苄青霉素100μg/mL，培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β‑半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，28℃条件下诱导7h后收集菌液；VI.水溶性VI型人胶原蛋白多肽的纯化条件(1)把步骤V收集的菌液，按每100mL培养基所得菌体加入4mL缓冲液，缓冲液与培养基的体积比为1∶25，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液，将重悬菌液进行超声波破碎；(2)在13000r/min条件下，4℃离心20分钟，上清为澄清的细胞粗提物，蛋白电泳显示VI型人胶原多肽的蛋白溶于上清液中，该粗提物经镍柱亲和层析，然后冷冻干燥，收集水溶性VI型人胶原蛋白多肽；纯化所用的缓冲液为Novagen公司Ni‑NTA缓冲液试剂盒(Ni‑NTABuffer Kit)提供；VII.用免疫印迹法分析纯化的可溶性VI型人胶原蛋白多肽的特异性取纯化后的可溶性VI型人胶原蛋白多肽，进行Western‑blotting检测，在46KDa处左右出现一条蛋白染色带，证明VI型人胶原蛋白多肽得到表达，且具有良好的特异性和免疫反应性。