[发明专利]一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法

摘要

一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，是针对甘蔗的特殊性利用球磨机对其叶片基因组DNA进行分离的技术。利用球磨机改变磁场使金属珠子一次对多个甘蔗叶片样品进行研磨的特点，优化了钢珠直径、液氮预处理时间、叶片用量、研磨时间等参数，建立了一种适合大批量提取甘蔗叶片基因组的方法。方法的主要步骤包括取样、预冻、研磨、化学抽提等步骤。该方法克服了目前制备甘蔗基因组DNA存在的磨样费时费力、操作繁琐、叶片用量大、交叉污染率高、效率低等缺点，具有适用范围广，简便快速、污染率低、取样量少等优点，特别适宜于大批量快速制备甘蔗叶片基因组。

主权项

1.一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特征在于：具体实施步骤如下：（1）根据样品数量，往1-45个2mL的离心管中每管放入1粒4mm直径不锈钢珠子；（2）取50-100mg的新鲜甘蔗叶片放入各离心管中，盖紧置于液氮中预冻30min-45min；（3）取出后迅速放入-20℃预冻的球磨机配套45孔研磨支架上，在球磨机里打磨30s-40s，取出离心管置于冰上；（4）往各离心管中加人1.0mL经65℃预热的提取缓冲液；（5）将离心管在65℃水浴40min，期间每隔5min颠倒混合一次离心管；（6）每管加入800μL酚﹕氯仿﹕异戊醇混合液，三种溶剂的体积比25﹕24﹕1，颠倒混匀至乳白色，室温静置10min，12,000r/min离心10min，取800μL上清液转移到新的离心管中，可重复抽提一次；（7）加入占上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，颠倒混合，12,000r/min离心10min，弃上清液，或将离心管置于-20℃冰柜中1h，用干净tip头或牙签挑出絮状DNA；（8）加入体积浓度为75%乙醇600-1000μL，颠倒清洗DNA，12,000r/min离心2-3min，弃上清液，重复操作一次；（9）DNA完全晾干后加入100μL双蒸水或TE溶解，-20℃保存备用。