[发明专利]一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法

摘要

一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，包括步骤：对小菜蛾样本进行单头基因组DNA的提取；对所述第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增；对所述PCR扩增后的产物进行回收；根据所述测序结果，检查所述回收得到的DNA的N-端是否出现突变位点，根据测序结果，对所述小菜蛾样本对阿维菌素类农药的抗性进行判别。本发明不需要大批量人工饲养试虫，节省劳动力和资源，所得抗性结果准确，且能反应昆虫抗性个体出现的频率。

主权项

一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于，包括步骤如下：第一步，对小菜蛾样本进行单头基因组DNA的提取，步骤包括，(1)将所述小菜蛾样本置于预冷的匀浆器中，加入TE缓冲液匀浆，(2)加入细胞裂解液，混匀，转入离心管中，再加入蛋白酶K，放置，期间摇匀若干次，直到样品为半透明粘稠液体，(3)加入氯仿，轻轻混匀，(4)加入沉淀液，室温放置，然后离心处理，(5)吸掉上清液，立即加入氯化钠溶液，轻轻振荡致沉淀完全溶解，加入RNA酶A，混匀，放置，(6)加入预冷的无水乙醇，放置，然后离心处理，吸走乙醇，用乙醇洗一次，倒置于干净滤纸上，室温干燥，用TE缓冲液溶解DNA，得到DNA模板，低温保存备用；第二步，对所述第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增，步骤包括，(1)在PCR管中建立PCR反应体系：PCR缓冲液，脱氧核糖核苷酸，上游引物，下游引物，DNA模板，DNA聚合酶，去离子水，(2)将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为：预变性后，变性，退火，延伸，多次循环，最后延伸，然后低温保存样品；第三步，对所述PCR扩增后的产物进行回收，步骤包括，(1)取所述PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶进行电泳，(2)紫外灯下迅速从所述琼脂糖凝胶上割下目的条带100～300毫克，置于微离心管中，紫外灯下操作不要超过30秒，(3)往离心管中加入的结合缓冲液约100‑300μL，55～60℃加热5～10分钟使胶完全溶化，每隔2‑3分钟混匀一次，(4)将所述第三步(3)中获得的混匀物转到回收柱中，于室温离心处理，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加结合缓冲液洗所述回收柱，于室温离心处理，除掉上清液，(6)加SWP缓冲液于所述回收柱中，离心处理，除掉上清液，(7)重复所述第三步中(5)、(6)一次，(8)离心处理后除净上清液，加入DNA溶解液，离心处理，(9)琼脂糖电泳检测回收结果；第四步，将所述回收得到的DNA低温贮存然后进行测序，或将所述回收得到的DNA立即进行测序；第五步，根据所述测序结果，检查所述回收得到的DNA的N‑端是否出现突变位点，即第78 位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸；第六步，根据第五步中的测序结果，对所述小菜蛾样本对阿维菌素类农药的抗性进行判别，如果出现所述第78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸之中的任一突变位点，就说明所述小菜蛾样本对阿维菌素出现了抗性。