[发明专利]一种利用标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系培育的方法

摘要

本发明涉及一种利用分子标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系培育的方法，属于作物育种技术领域，用于萝卜杂种优势利用中优良雄性不育系的高效培育。本发明技术方案为：筛选出性状优良、育性稳定的自交系；选用特异引物NAUmsF4与NAUmsR4对筛选出的自交系进行PCR扩增，确定能够扩增出1069bp特异条带的自交系不可做为候选保持系；对于未能扩增出该特异条带的自交系，进行恢复基因功能标记分析，筛选出可做为候选保持系的自交系；将原始不育系与鉴定出的候选保持系杂交、4-5代回交，即可获得性状优良的新不育系和相应保持系。本发明利用分子标记快速筛选候选保持系，不受生育期和环境影响，可显著提高萝卜CMS不育系培育效率，加快优良F1杂种选育进程。

主权项

一种利用分子标记辅助选择进行萝卜CMS雄性不育系的培育方法，其特征在于：1)CMS胞质不育基因鉴定对萝卜自交系，提取基因组DNA，用标记引物进行PCR扩增，正向引物NAUmsF4序列为AAAACGCCGCCCAAATACG，反向引物NAUmsR4序列为TTCAACAAATCCCTCCAGACAGC；PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，32个循环；72℃延伸10min；PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，能够扩增出1069bp特异片段的自交系携有ogura胞质雄性不育基因，不能做为候选保持系用于新CMS雄性不育系培育，将其淘汰；2)CMS恢复基因功能标记分析对于步骤1)未扩增出1069bp特异片段的自交系材料，用特异引物进行PCR扩增，正向引物NAUrfoF4序列为AATACTGAACCGGAACTCTACTGG，反向引物NAUrfoR4序列为TGCAGCAGCAGAAACAAAAT；PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 50s，56℃ 50s，72℃ 1.5min，35个循环；72℃延伸10min；对此扩增产物进行限制性内切酶SspI酶切，20μl体系包括8μl PCR产物与7.5U内切酶SspI，37℃下温浴3h；酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果有2个酶切位点产生大小分别为1538bp，629bp，363bp的3个酶切片段，表明该萝卜自交系携有育性恢复基因，不能用做候选保持系，也将其淘汰；剩下的自交系如果只有1个酶切位点产生2167bp与363bp的2个酶切片段，表明该萝卜自交系不携有恢复基因，选做候选保持系用于新CMS雄性不育系培育；或者对步骤1)胞质不育基因鉴定中未扩增出1069bp特异片段的自交系，用恢复基因特异标记引物进行PCR扩增，正向引物NAUrfoF10序列为ATATACAGCTTCACCATTC，反向引物NAUrfoR10序列为CTACCAGAGCTACAAAAAC；程序为：94℃ 3min；94℃ 50s，50℃ 50s，72℃ 1.5min，32个循环；72℃延伸10min；能扩增出575bp特异片段的自交系则不携有CMS恢复基因，选做为候选保持系用于新CMS雄性不育系培育；3)将获得的候选保持系做为轮回亲本与不育系杂交，回交4‑5次，即可获得新的CMS雄性不育系，用于杂种种子生产中。