[发明专利]一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法

摘要

本发明公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法。具体是将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶。本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统生产α-乙酰乳酸脱羧酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。

主权项

一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α‑乙酰乳酸脱羧酶的方法，其特征在于：1)整合型重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是将α‑乙酰乳酸脱羧酶表达元件克隆到质粒pMLK83或其衍生质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，在含新霉素20ug/ml的LB固体培养基上，挑选出新霉素抗性以及α‑淀粉酶缺失的菌株，即为外源基因通过双交换整合到染色体中的重组枯草芽孢杆菌；所述的α‑乙酰乳酸脱羧酶表达元件，包含(1)能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，例如来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；(2)能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断，例如来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α‑乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因SacB信号肽DNA片断；(3)来源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的α‑乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α‑乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子，也可以是来源于其它菌的α‑乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子；所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800；2)以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α‑乙酰乳酸脱羧酶的方法是，以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种在营养培养基中发酵生产α‑乙酰乳酸脱羧酶，生产步骤如下：(1)所述整合型重组枯草芽孢杆菌，是将α‑乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到宿主枯草芽孢杆菌染色体中，经过筛选得到的整合型重组枯草芽孢杆菌；(2)所述的营养培养基，为包含0.1‑5％胰化蛋白胨，0.1‑5％酵母提取物，0.5‑2％NaCl的液体培养基，或相同蛋白质含量的水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液体培养基；(3)α‑乙酰乳酸脱羧酶的生产方法，包括接种、培养、分离和浓缩，具体操作是：以构建的重组枯草芽孢杆菌菌株为菌种，在温度30～40℃，pH 6.0～8.0，好氧条件下按0.5％～15％接种量扩增菌种和发酵，好氧发酵18‑48小时，发酵液在400～16000g离心力离心或在孔径0.2～0.6um过滤除菌，上清液在截留分子量5000～10000超滤膜浓缩后，得到成品α‑乙酰乳酸脱羧酶，4～10℃低温保存。