[发明专利]杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法

摘要

本发明公开了一种杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法。该方法包括杉木未成熟种子胚的准备、ESM的起始诱导、EMS的维持与增殖、体胚的成熟前期培养、体胚的成熟培养和体胚的萌发。本发明再生杉木植株的方法，其优势在于繁殖系数高、繁殖不受季节的限制，为杉木遗传改良材料的快速繁殖提供了一种高效途径，不仅有利于杉木遗传资源的保存，而且对于加速杉木优良材料的繁育，提供大量经遗传改良的种植材料，缓解社会对杉木遗传改良苗木的紧迫需求，提供了一种周期短、效率高、成本低的良种苗木的生产技术。

主权项

一种杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)杉木未成熟种子胚的准备采集杉木杂交组合的球果，在解剖镜下观察杉木合子胚，取发育至胚胎选择、优势胚、柱状胚和早期子叶胚阶段的杉木球果，迅速置于4℃条件下冷藏保存一周。在无菌条件下，剥取球果中的未成熟种子胚备用；(2)ESM的起始诱导在无菌条件下，将未成熟种子胚接种至诱导固体培养基中，每个培养皿接种8粒种子胚，控温23℃、暗培养13～18天，诱导获得ESM；其中，诱导固体培养基的配方为：DCR为基本培养基，附加2，4‑D 2～6mg/L，6‑BA 0.5～1.0mg/L，KT 0.5mg/L，Vc 10mg/L，L‑Gln 0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇0.1g/L，麦芽糖15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3g/L；(3)EMS的维持与增殖在无菌条件下，将步骤(2)中诱导获得的EMS转入维持固体培养基中，控温23℃，暗培养20天；其中，EMS的维持固体培养基的配方为：DCR基本培养基，2，4‑D0.5‑2mg/L，6‑BA 0.2‑0.5mg/L，KT 0.5mg/L，Vc 10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇0.1g/L，麦芽糖20‑25g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.5g/L；将维持培养20天后的EMS移入液体增殖培养基，控温23℃，摇床转速为85～90r.p.m，暗培养7天；其中，液体增殖培养基的配方为：DCR基本培养基，2，4‑D0.5‑2mg/L，6‑BA 0.2mg/L，Ac 10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇2g/L，麦芽糖30g/L；(4)体胚的成熟前期培养在无菌条件下，将步骤(3)中经增殖培养的EMS转移到成熟前期液体培养基中，控温23℃，摇床转速为85r.p.m，暗培养7天；其中，成熟前期液体培养基配方为：DCR基本培养基，ABA 5‑10mg/L，GA 0.1～1.0mg/L，Vc 10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇5g/L，麦芽糖30g/L；(5)体胚的成熟培养在无菌条件下，将步骤(4)中经成熟前期培养的材料转移到成熟培养基中，控温23℃，暗培养30天后，培养出长为4～5mm的子叶胚；其中，成熟培养基的配方为：DCR基本培养基，ABA 3‑8mg/L，GA1‑5mg/L，Vc 10mg/L，PEG 8000 100‑200g/L，谷氨酰胺0.45g/L，L‑Pro 0.2g/L，L‑Asp 0.2g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇5g/L，麦芽糖30g/L，活性炭2.5g/L，水晶洋菜2.5g/L；(6)体胚的萌发在无菌条件下，将长为4～5mm的子叶胚转移至固体DCR基本培养基，常规培养直至萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。