[发明专利]一种测定制浆黑液还原糖含量的方法

摘要

本发明提供一种采用3，5-二硝基水杨酸双波长分光光度法测定制浆黑液中还原糖含量的方法。本发明能排除黑液中木素对还原糖含量测定的影响。通过对木素与葡萄糖在3，5-二硝基水杨酸溶液中紫外-可见特定波长区域吸收谱图的分析，结合木素和葡萄糖各波长处吸光度值与浓度比例系数的对比值，确定了测试适宜波长。通过对木素DNS溶液在520nm和570nm吸光度值与木素浓度关系曲线，确定双波长差示信号放大系数。木素葡萄糖溶液差示信号与浓度之间比例系数与未加木素的葡萄糖溶液比例系数之间校正系数为k＝1.2。本发明能反映酶解过程中黑液中还原糖含量变化；测定加入葡萄糖的酶解后黑液中还原糖含量，具有较好的稳定性，测定结果较理想。

主权项

一种测定制浆黑液还原糖含量的方法，其特征在于按以下步骤进行操作：第一步、3，5‑二硝基水杨酸溶液配制，称取6.3g 3，5‑二硝基水杨酸和262ml2mol·l‑1氢氧化钠溶液加入酒石酸钾钠热溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后定容至1000ml，储存于棕色瓶，放置72h后使用；第二步、木素的提取，取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至pH6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作2～3次，取离心后沉淀物置于80℃真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素；第三步、木素的提纯，将粗木素溶于140ml吡啶‑醋酸‑水体系中，用180ml氯仿萃取，静置4h分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层；上层溶液中加入150ml氯仿再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层；合并两次有机层萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至95～105ml，移至1000ml无水乙醚中，搅拌使析出沉淀，将沉淀用乙醚洗涤，至无吡啶味为止，置于P2O5的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素；第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制，定量称取分析纯葡萄糖，用pH 4.8的醋酸‑醋酸钠缓冲液配制成1g/L葡萄糖标准溶液；准确称取精制木素，配制成0.05g/ml木素的3，5‑二硝基水杨酸溶液，然后用去离子水定容，得0.01g/ml木素标准溶液；第五步、放大系数的确定，通过测定不同木素含量3，5‑二硝基水杨酸溶液在波长520nm和570nm处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线，其线性关系方程分别为A520木素＝ε520木素c木素+N1木素，A570木素＝ε570木素c木素+N2木素；通过测定不同葡萄糖含量3，5‑二硝基水杨酸溶液在波长520nm和570nm处吸光度值，得到葡萄糖标准液用量与两波长处吸光度关系曲线图，其线性方程分别为A520葡萄糖＝ε520葡萄糖c葡萄糖+N1葡萄糖，A570葡萄糖＝ε570葡萄糖c葡萄糖+N2葡萄糖，得到差示信号S0＝K2(A520木素+A520葡萄糖)‑K1(A570木素+A570葡萄糖)＝(ε570木素ε520葡萄糖‑ε570葡萄糖ε520木素)c葡萄糖+N0；第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式的确定，通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值S1，作图得到差示信号S1与葡萄糖浓度关系标准曲线，由标准曲线线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式：S1＝ε1c葡萄糖+N1，测定一组即含葡萄糖又含木素的DNS溶液520nm和570nm处吸光度值，并计算出各编号溶液差示信号值S2，得到混合液差示信号与葡萄糖标准溶液关系曲线，得计算公式S2＝ε2c葡萄糖+N2，取校正系数k＝ε2/ε1，经校正后差示信号与葡萄糖关系式为S＝k·S2＝εc葡萄糖+N，则可计算得到还原糖含量与差示信号间计算公式；第七步、黑液中还原糖含量测定，将黑液调pH值至5，加入适量pH4.8醋酸‑醋酸钠缓冲液，离心去除其中不溶物，取离心清液，稀释适当倍数，取其中5ml于预先加入5ml pH4.8醋酸‑醋酸钠缓冲液，3ml3，5‑二硝基水杨酸溶液的比色管中，煮沸5min后迅速冷却后用去离子水定容至25ml。以3ml3，5‑二硝基水杨酸溶液定容至25ml溶液为参比，测定溶液520nm及570nm处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量；其中，酒石酸钾钠溶液是由182g酒石酸钾钠溶于500ml去离子水配制而成的；吡啶‑醋酸‑水的体系组成为吡啶∶醋酸∶水的体积比为9∶1∶4；N为常数，分别为N、N0、N1、N2、N1木素、N2木素、N1葡萄糖、N2葡萄糖。