[发明专利]野蚕抗病毒蛋白SP-2的大量表达方法

摘要

本发明公开了一种野蚕抗病毒蛋白SP-2的大量表达方法，其步骤为：(1)进行野蚕抗病毒蛋白SP-2基因的克隆；(2)进行含有野蚕抗病毒蛋白SP-2基因的重组杆状病毒的构建；(3)在家蚕体内表达和纯化野蚕SP-2。本发明利用家蚕杆状病毒作为载体，构建含有野蚕抗病毒蛋白SP-2基因的重组病毒；利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主，表达了具有生物学活性的野蚕抗病毒蛋白SP-2。本发明表明：利用重组杆状病毒以家蚕作为宿主，表达SP-2的蛋白质含量较高，因此可利用本发明进行大量表达野蚕抗病毒蛋白SP-2，由此为抗病毒蛋白SP-2在养蚕业中的应用开辟了广阔的前景。

主权项

一种野蚕抗病毒蛋白SP‑2的大量表达方法，其特征在于步骤如下：(1)按以下方法进行野蚕抗病毒蛋白SP‑2基因的克隆：解剖5龄野蚕的中肠后部组织，用Trizol法抽提总RNA，根据家蚕Bm SP‑2基因序列，设计一对引物，其中，上游引物的序列为5′‑atgaaggtcttcgcagcagtac‑3′，下游引物的序列为5′‑attcgccagtcgtcatttaaattc‑3′；取2μl RNA为模板，用禽白血病病毒反转录酶AMV第一链cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA；接着进行PCR反应，所述PCR反应体系的总体积为20μl，其中，RNA模板0.5μg、上游引物和下游引物各6pmol、DNA聚合酶1.25U、dNTP 5umol、PCR Buffer 2.5μl，所述PCR反应按以下条件进行：94℃，3min；94℃，50s；55℃，30s；72℃，1min；反应30个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物经1％低溶点琼脂糖凝胶电泳后，切下相应的DNA条带，试剂盒回收，将上述DNA条带与pGEM T‑Easy载体连接，并转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；随后筛选白色菌落并挑斑培养，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，以pGEMT‑Easy多克隆位点两端的T7和SP6启动子序列为引物进行双向测序，获得克隆的野蚕抗病毒蛋白SP‑2基因；(2)按以下方法进行含有野蚕抗病毒蛋白SP‑2基因的重组杆状病毒的构建：将克隆的野蚕SP‑2抗病毒蛋白基因克隆入杆状病毒Bac‑to‑Bac表达系统所提供的供体质粒pFastBacHTc EcoRI位点，用BamHI、PstI酶切和电泳鉴定方法确认插入方向的正确性；然后将该含有野蚕SP‑2基因的供体质粒转化入大肠杆菌DH10BmBac细胞，并在LB液体培养基上振荡培养4h，然后取部分稀释菌液涂板，在含有Kanamycin、X‑gal的LB培养板上培养48h；挑取白斑进行单菌斑培养，抽提得到重组BmBacmid基因；随后将所述重组BmBacmid基因分别转染入家蚕培养细胞获得含有野蚕抗病毒蛋白SP‑2基因的重组杆状病毒；(3)按以下方法在家蚕体内表达和纯化野蚕SP‑2：用所述含有野蚕抗病毒蛋白SP‑2基因的重组杆状病毒作为载体在家蚕5龄幼虫中进行表达，将病毒液经口接种所述家蚕幼虫实现病毒感染，随后从感染后96小时的所述家蚕幼虫中分离、纯化重组野蚕SP‑2蛋白。