[发明专利]基于引物保护解除的甲基化DNA的检测方法

摘要

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续序列，合成带有尾引物序列的PCR引物；步骤3，加入TaqDNA聚合酶和具有3’~5’外切酶活性DNA聚合酶进行PCR扩增反应；步骤4，以带有荧光标记的尾引物进行第二次PCR扩增；步骤5，测定DNA片段在毛细管电泳的迁移率并判定样品中是否存在甲基化DNA。本发明提高了检测结果的可靠性，灵敏度高；在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

主权项

一种基于引物保护解除的甲基化DNA的检测方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理并纯化待测DNA、标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA；步骤2，确定待测基因的检测区域，在所要检测的基因序列中，选择一段含有多个CpG位点的序列作为目标检测序列进行引物设计，以该段序列的5’端的一段序列作为PCR正向引物，以该段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR反向引物；并将20碱基长度的T7序列加在正向引物的5’端作为T7尾引物序列，将20碱基长度的T3序列加在反向引物的5’端作为T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板， 加入Taq DNA聚合酶和具有3’~5’外切酶活性DNA聚合酶，用所述的正向和反向PCR引物，对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行PCR扩增；并以亚硫酸盐处理过的标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为对照；步骤4，以步骤3所得的PCR产物为模板，以所述T3和荧光标记的T7尾引物进行第二次PCR扩增；步骤5，用核酸分析仪测定步骤4所得PCR扩增产物的DNA片段在毛细管电泳的迁移率；步骤6，将步骤5所测结果与标准DNA样品结果对照，如果待测样品中出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA；反之，如果待测样品中不出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则表明待测样品中不存在甲基化DNA。