[发明专利]基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法

摘要

本发明涉及一种甲基化DNA的定量检测方法，包括以下步骤：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA样品和标准DNA样品；步骤2，设计并合成PCR引物；步骤3，对标准DNA进行PCR扩增，并测定解链温度；步骤4，对待测DNA进行PCR扩增；步骤5，将待测DNA的PCR扩增产物加热到一特定温度后立即冷却；步骤6，对PCR产物进行消化；步骤7，加入对双链DNA特异的荧光染料，以荧光分光光度计测定荧光强度，并计算甲基化DNA含量。该方法操作简单，检测灵敏度高，特异性强，适用范围大，并且不受干扰，在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

主权项

一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA、和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择含多个CpG位点的一段序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，用所述步骤2所设计的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶，以实时定量PCR仪进行PCR扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；步骤4，以亚硫酸盐处理的待测DNA样品作为PCR模板，在与步骤3相同的条件下，进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，将冷却后的产物分为两部分，一部分加入单链DNA特异性核酸内切酶，另一部分不加单链DNA特异性核酸内切酶，在相同的反应条件下进行消化，得到消化产物；步骤7，向步骤6所得消化产物中分别加入对双链DNA特异的荧光染料，用荧光分光光度计测定双链DNA的含量。